蠅蛆肽對衰老小鼠的抗氧化作用

趙春江 魏 洪 夏冰天 文 雪 李俞亭 佘曉玲

(貴州醫科大學，貴州 貴陽 550025)

研究安全又經濟的天然抗氧化劑替代不安全的化學抗氧化劑已成為一大熱點〔1〕。而在食品業、藥業等領域應用廣泛的天然生物活性肽，具有高效、低毒、無污染等特點〔2〕。家蠅(Musca domestica L)幼蟲體內具有抗氧化活性的蛋白質〔3，4〕，本研究以家蠅幼蟲為原料通過40%固相萃取制備蠅蛆肽〔5〕，通過前期研究發現蠅蛆肽具有抗腫瘤作用，可清除S180小鼠體內的自由基〔6〕，本文探討蠅蛆肽對D-半乳糖(D-gal)致衰老模型小鼠的抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 昆明種3月齡小鼠60只，雌雄各半，體重(33.13±2.66)g，均由貴州醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(黔)2012-0001；家蠅：由貴州醫科大學感染與免疫實驗室飼養傳代，幼蟲飼養參考文獻〔7〕；蠅蛆肽的制備：取3日齡家蠅幼蟲，制備方法參照文獻〔5〕；D-gal購自GENVIEW公司，批號4304020140)；維生素C片購自東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司(批號5131035)；蛋白定量測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；TGL-16M高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；SJIA-10N冷凍干燥機(寧波市雙嘉儀器有限公司)；SC-2546低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；UV-1200紫外分光光度計(上海美析儀器有限公司)。

1.2實驗動物模型制備〔8，9〕及給藥方法 小鼠適應性飼養1 w后隨機分為正常對照組(K組)，模型組(A組)，維生素C組(V組)，蠅蛆肽低、中、高劑量組(L組、M組、H組)，每組10只。除K組頸背部注射生理鹽水外，其余組均采用頸背部每日皮下注射D-gal溶液100 mg/kg，K組注射同劑量的生理鹽水。L、M、H組分別每天1次灌胃蠅蛆肽50、100、200 mg/kg，V組每天1次灌胃維生素C 100 mg/kg。實驗期間觀察小鼠的外觀變化及每周測一次體重，7 w后處死小鼠，測定各項抗氧化指標。

1.3指標測定 實驗結束時稱量小鼠體重。摘眼球采血，離心取血清并用于檢測SOD和CAT活性及MDA含量。采集腦、胸腺、肝臟和脾臟并稱重，計算小鼠肝臟、胸腺和脾臟指數。肝臟和腦組織各取0.1～0.2 g制備10%肝臟組織勻漿和10%腦組織勻漿，小鼠肝臟組織和腦組織SOD、CAT及GSH-Px活性和MDA含量采用試劑盒說明書進行測定。

1.4統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行用單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組外觀特征及體重 連續皮下注射D-gal 7 w后，L、M、H組和K組毛色有光澤，活潑易動，精神狀態良好；A組則表現出毛色失去光澤，行動緩慢，反應遲鈍等一系列體征。試驗期間，所有給藥組動物一般狀態良好，L、M、H組體重差異均無統計學意義(P>0.05)，說明蠅蛆肽對小鼠的生長發育無不良影響，見表1。

表1 各組實驗期間體重比較

2.2各組臟器指數 與K組比較，A組胸腺、脾和肝臟指數均顯著降低(P<0.01)；與A組比較，L、M、H、V組胸腺、肝臟指數均升高(P<0.05或P<0.01)，與A組比較，M、H、V組脾指數升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組臟器指數比較

與K組比較：1)P<0.01；與A組比較:2)P<0.05，3)P<0.01；表4同

2.3各組血清、肝臟和腦組織中SOD活力比較 與K組比較，A組血清、肝臟和腦組織中SOD含量顯著降低(P<0.01)。與A組比較，L、M、H、V組肝臟和腦組織中SOD活性升高(P<0.05或P<0.01)，M、H、V組血清中SOD活性升高(P<0.05)。見表3。

2.4各組血清、肝臟和腦組織中MDA含量 與K組比較，A組血清、肝臟和腦組織中MDA含量顯著升高(P<0.01)。與A組比較，L、M、H、V組血清、肝臟和腦組織中MDA含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表3 各組血清、肝臟和腦組織中SOD活力比較

與K組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；與A組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

2.5各組血清、肝臟和腦組織中CAT活力 與K組比較，A組血清、肝臟和腦組織中CAT活性顯著降低(P<0.01)，與A組比較，L、M、H、V組血清和肝臟組織中CAT活性顯著升高(P<0.05或P<0.01)，M、H、V組腦組織中CAT活性顯著升高(P<0.05)。見表4。

2.6各組肝臟和腦組織中GSH-Px活力 與K組比較，A組肝臟和腦組織中GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01)，與A組比較，L、M、H、V組肝臟組織中GSH-Px活性顯著升高(P<0.05或P<0.01)，M、H、V組腦組織中GSH-Px活性顯著升高(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4 各組血清、肝臟和腦組織中MDA、CAT、GSH-Px含量

3 討 論

本實驗采用在抗衰老研究中應用廣泛的D-gal衰老模型，該模型不僅衰老變化明顯，又較成熟穩定〔10,11〕。自由基的損傷在衰老機制的研究中被廣泛接受〔12〕。機體在正常生理情況下，其抗氧化防御系統的完整能防止自由基反應和阻斷脂質過氧化物形成，從而維持生成與清除的動態平衡〔13〕。

胸腺和脾臟是機體內重要的免疫器官，前者位于機體中樞，后者位于機體外周，兩者均能產生與免疫調節相關的活性物質，因此，兩者的功能和狀態直接影響機體的免疫功能〔14～16〕，積累的自由基會損傷機體內重要的肝臟，其為機體內代謝和解毒器官。實驗結果提示，各個劑量的蠅蛆肽組與模型組相比，均能不同程度提高胸腺、脾臟和肝臟指數，與文獻中報道的蠶蛹多肽對D-gal衰老小鼠的作用效果相似〔17〕，體現出蠅蛆肽具有作為提高機體免疫力保健品的開發價值。

SOD作為專一清除超氧陰離子自由基的抗氧化物酶，對維持機體氧化與抗氧化平衡有重要意義，其活力間接反映機體清除自由基的能力〔18,19〕。MDA是細胞膜脂質過氧化產物之一，可進一步與磷脂酰乙醇胺和蛋白質交聯，使細胞脆性增加和變形性降低，從而導致生物膜結構和功能改變〔20〕。研究表明黃緣盒龜多肽能提高SOD活性并降低MDA 含量〔21〕，與本試驗中、高劑量蠅蛆肽實驗效果相似，說明蠅蛆肽具有清除機體內自由基、對抗自由基損傷引起的機體衰老過程的能力。

GSH-Px通過特異性的催化還原型GSH，阻斷過氧化物的還原反應，防止過氧化物對細胞膜及機體的損害。廣泛存在于機體中的CAT具有重要的生理學功能并保護細胞〔20，22〕。GSH-Px和CAT可保護細胞膜結構和功能的完整，均是廣泛存在于機體內重要的抗氧化物酶，對H2O2分解起到催化作用〔23〕。包怡紅等〔24〕試驗表明乳清蛋白肽能提高小鼠GSH-Px和CAT活性，本試驗結果說明蠅蛆肽具有和乳清蛋白肽相似的作用，催化H2O2生成無毒的H2O和O2，拮抗自由基對機體的損傷。以上結果提示，蠅蛆肽可能通過提高SOD、CAT、GSH-Px活性，增強對自由基的清除能力，降低MDA含量，抑制脂質過氧化，從而延緩衰老。

1王紅梅，闞 娟.生物活性肽的功能特性〔J〕.江蘇調味副食品，2008；25(2)：37-9.

2吳甜甜，楊 潔.天然抗菌肽的研究進展及應用前景〔J〕.生物技術通報，2009；(1)：27-30.

3王芙蓉，黃 文，王艷麗，等.家蠅幼蟲活性蛋白組分的提取及清除羥自由基活性研究〔J〕.昆蟲知識，2005；42(5)：546-9.

4姜 寧，張愛忠，李玲玲，等.蠅蛆肽對大鼠機體抗氧化和免疫指標的影響〔J〕.動物營養學報，2009；21(4)：561-6.

5Fu P，Wu JW，Guo G.Purification and molecular identification of an antifungal peptide from the hemolymph of Musca domestica(housefly)〔J〕.Cell Molec Immunol，2009；6(4)：45-8.

6魏 洪，吳建偉，王碩石，等.家蠅幼蟲血淋巴提取物抗腫瘤作用〔J〕.中國公共衛生，2013；29(2)：217-9.

7梁文惠.藥渣飼養家蠅對生態學、營養價值和先天免疫的影響〔D〕.貴陽：貴陽醫學院，2013.

8余資江，應大君，董世武，等.半乳糖急性致衰老動物模型劑量的探討〔J〕.解剖學雜志，2005；28(4)：422-4.

9徐淑云.藥理實驗方法學〔M〕.第3版.北京：人民衛生出版社，2002：1465-6.

10秦紅兵，楊朝曄，范憶江，等.D-半乳糖誘導衰老小鼠模型的建立與評價〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2009；13(7)：1275-8.

11邢秋娟，施 杞，王擁軍.D-半乳糖誘導衰老動物模型的機制及其在中醫藥方面的應用〔J〕.上海中醫藥大學學報，2010；24(3)：93-8.

12Droge W.Oxidative stress and aging〔J〕.Adv Exp Med Biol，2003；543：191-200.

13李素云，王立芹，鄭稼琳，等.自由基與衰老的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2007；27(20)：2046-8.

14侯 茜，郭 美，張 帆.黨參水煎劑對D-半乳糖致免疫衰老小鼠胸腺功能的影響〔J〕.細胞與分子免疫學雜志，2014；30(1)：55-7.

15Tarantino G，Scalera A，Finelli C.Liver-spleen axis：intersection between immunity，infection and metabolism〔J〕.World J Gastroenterol，2013；19(23)：3534-42.

16雷 超，張力華，蘇 婷.加味四君子湯對衰老大鼠的脾臟及細胞因子的影響〔J〕.中國中醫藥雜志，2014；29(9)：2941-4.

17盧 楠，毛 愷，廖鮮艷,等.蠶蛹多肽提高D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化及免疫能力〔J〕.食品工業科技，2013；34(12)：331-4.

18李 玲，唐 艷，農皓如，等.水牛乳多肽對衰老模型小鼠機體抗氧化作用的研究〔J〕.食品科技，2012；37(9)：62-5.

19彭新顏，孔保華，熊幼翎.乳清多肽對D-半乳糖衰老模型大鼠血清和臟器組織抗氧化效果的影響〔J〕.食品科學，2010；31(9)：238-42.

20馬朝陽，馬淑鳳，王 芳，等.蘆筍提取物的抗氧化作用的研究〔J〕.食品工業科技，2012；33(22)：365-8.

21萬 全，王艷梅，林 琳，等.黃緣盒龜多肽對D-半乳糖致亞急性衰老小鼠抗氧化能力的影響〔J〕.現代食品科技 2013；29(9)：2075-80.

22唐 靜.不同劑量川牛膝多糖對小鼠抗氧化活性的影響〔D〕.成都：四川農業大學，2013.

23王 挺，李 弋.雙歧桿菌對D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用〔J〕.中國老年學雜志，2007；27(1)：47-8.

24包怡紅，李銳達，梁 雪，等.乳清蛋白肽對衰老小鼠抗氧化能力的影響〔J〕.營養學報，2010；32(3)：239-41.