抗TNF-α IgY滴鼻對老年大鼠過敏性鼻炎的治療作用

董金輝 任秀敏 王建星 徐 鷗

(河北醫科大學第二醫院耳鼻咽喉科，河北 石家莊 050000)

過敏性鼻炎是一種變應性鼻炎，隨著大氣環境的改變，其發生率不斷提高，有從季節性向常年性轉變的傾向，對人們的生活質量造成嚴重影響〔1～3〕。過敏性鼻炎主要采用藥物治療〔4,5〕。其中糖皮質激素能夠抑制免疫反應，但長時間應用副作用比較大，甚至出現耐藥現象；抗組胺藥物等炎癥介質抑制劑只能緩解癥狀，且費用比較高，副作用大。腫瘤壞死因子(TNF)-α為過敏性鼻炎的炎癥因子，也能夠刺激平滑肌、氣道上皮、免疫活性細胞等產生多種炎癥因子，對嗜酸性粒細胞的浸潤有促進作用〔6〕。本研究對過敏性鼻炎模型老年大鼠給予抗TNF-α免疫球蛋白(Ig)Y滴鼻治療，探討其對老年大鼠過敏性鼻炎的治療效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級、雌雄不限、20～22月齡、體重350～410 g的老年大鼠28只，購自南方醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2006-0012，實驗經倫理委員會批準。

1.2主要試劑和儀器 非特異性IgY、抗TNF-α IgY、雞卵清蛋白、氫氧化鋁凝膠(美國sigma公司)等；顯微鏡(德國Leica公司)、離心機(美國Beckman Coulter公司)等。

1.3建模及分組 建立老年大鼠過敏性鼻炎模型并隨機分為4組：A組(正常對照組)、B組(模型組)、C組(非特異性IgY治療組)和D組(抗TNF-α IgY治療組)，B、C、D組均建立過敏性鼻炎動物模型。基礎致敏：將0.3 mg卵清蛋白、30 mg氫氧化鋁粉末和生理鹽水1 ml制成混懸溶液，每只大鼠隔日1次腹腔注射，共注射7次；然后用2.0%卵清蛋白滴鼻激發，1次/d，每次每側鼻孔0.1 ml；第4天時，B組給予生理鹽水0.1 ml滴鼻、C組給予非特異性IgY 0.1 ml滴鼻、D組給予抗TNF-α IgY 0.1 ml滴鼻后，均再給予2.0%卵清蛋白滴鼻激發，共7 d。A組在其余3組基礎免疫及激發(加強免疫)時均給予0.1 ml生理鹽水滴鼻。

1.4癥狀分級評分 每次激發后觀察半小時，觀察老年大鼠的噴嚏次數、流涕程度和鼻癢等，每一癥狀根據嚴重程度分為1～3分:打噴嚏：1分為打噴嚏1～3個，2分為打噴嚏4～10個，3分為打噴嚏11個及以上；流鼻涕：1分為流至前閉孔，2分為流涕超過前閉孔，3分為流涕滿面；抓鼻：1分為輕抓鼻1～2次，3分為劇烈抓鼻，2分介于1分和3分之間；總分5分以上為過敏性鼻炎建模成功。上述老年大鼠癥狀積分均在5分以上，均建模成功。分別記錄激發第4天治療前和治療結束后各組老年大鼠的癥狀積分情況。

1.5鼻黏膜蘇木素-伊紅(HE)染色 處死各組老年大鼠，分離老年大鼠鼻黏膜，甲醛固定，鹽酸甲醛脫鈣，取鼻黏膜中段，進行常規HE染色，顯微鏡下觀察HE染色情況。

1.6鼻黏膜嗜酸性粒細胞計數 每只老年大鼠鼻黏膜切片取8個區域，計數嗜酸性粒細胞所占比例，取平均值。

1.7鼻灌洗液中炎癥細胞含量測定 老年大鼠經水合氯醛麻醉后，取仰臥頭低位，從一側鼻腔中緩慢滴入磷酸鹽緩沖液(PBS)，移液槍在對側鼻腔中抽吸，置于EP管中，將各組鼻灌洗液細胞涂片，加入瑞氏吉姆薩染液染色，PBS沖洗，晾干后高倍鏡下計數500個炎癥細胞并計算百分比。

1.8統計學方法 采用SPSS20.0軟件，多組均數比較采用方差分析，組內兩兩均數比較采用LSD檢驗。

2 結 果

2.1各組治療前后癥狀積分比較 治療前，B組、C組和D組癥狀積分均顯著高于A組(P<0.05)；治療后,B組和C組癥狀積分顯著高于A組和D組(P<0.05)，A組和D組癥狀積分比較差異無統計學意義(P>0.05)；組內比較:D組治療后癥狀積分低于治療前(P<0.05)，A、B、C組治療前后比較癥狀積分差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組治療前后癥狀積分比較

與A組比較:1)P<0.05；與B組比較:2)P<0.05；與C組比較:3)P<0.05；下表同

2.2各組鼻黏膜HE染色情況 A組鼻黏膜偶見淋巴細胞浸潤；B組和C組鼻黏膜水腫，見固有層和上皮層有大量淋巴細胞和嗜酸性粒細胞，有上皮細胞脫落，血管中見炎性細胞浸潤；D組鼻黏膜輕度水腫，上皮層和固有層有少量淋巴細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，上皮比較完整。見圖1。

圖1 各組鼻黏膜HE染色(×200)

2.3各組鼻黏膜中嗜酸性粒細胞的變化情況 與A組〔(0.59±0.27)%〕比較，B組、C組和D組鼻黏膜中嗜酸性粒細胞所占比例均升高〔(12.53±2.12)%，(11.76±1.87)%，(6.97±1.64)%，均P<0.05〕；與B組和C組比較，D組鼻黏膜中嗜酸性粒細胞所占比例下降(P<0.05)；B組和C組鼻比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4各組老年大鼠鼻灌洗液中炎癥細胞比較 與A組比較，B、C、D組鼻灌洗液中淋巴細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞含量顯著升高(P<0.05)，巨噬細胞含量顯著降低(P<0.05)；與B組和C組比較，D組鼻灌洗液中嗜酸性粒細胞含量顯著降低(P<0.05)，巨噬細胞含量顯著升高(P<0.05)；B組和C組鼻灌洗液中各炎癥細胞含量比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組鼻灌洗液中炎癥細胞比較

3 討 論

過敏性鼻炎的特點為IgE抗體和嗜酸性粒細胞及肥大細胞上的受體結合，使嗜酸性粒細胞和肥大細胞釋放組胺、白三烯、血管內皮生長因子、TNF-α等多種化學物質及炎性因子，促進組織水腫、血管擴張、流涕、打噴嚏、鼻癢及氣道高反應等過敏反應癥狀和體征〔7,8〕；隨后出現晚期過敏反應，其為Th2細胞因子依賴性的，表現為TNF-α、白細胞介素(ILs)、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等多種細胞和細胞因子升高，分泌黏液，引起炎癥性病理變化〔9,10〕。過敏性鼻炎IgE抗體作用引起的早期過敏反應產生的TNF-α等原炎性因子能夠刺激Th2細胞分泌IL-4、IL-5等Th2細胞因子，鼻黏膜上皮細胞、平滑肌細胞、B細胞、T細胞、單核/巨噬細胞等多種細胞產生TNF-α等原炎癥因子和IL-6、IL-8等炎癥因子，增加內皮細胞白細胞黏附分子-1、細胞間黏附分子-1和血管細胞黏附分子-1等的表達，加重氣道的高反應性，加重過敏性鼻炎的炎癥改變〔11〕；同時抑制Th1細胞因子的分泌，引起Th1/Th2細胞免疫調節的平衡失調，引起炎癥細胞在鼻黏膜的聚集、增殖和活化〔12〕。

在免疫反應過程中，分為抗原識別、免疫細胞反應和免疫效應3個階段，在免疫激活極端，抗原難以準確發現，特異性免疫治療應用范圍有限；在免疫細胞反應階段，免疫反應自動完成，只有化療藥物抑制細胞周期能夠發揮作用，其他藥物基本沒有效果；在免疫效應階段，相應的抗體(IgE抗體等)效果也不穩定。阻斷原炎癥因子反應階段(即效應階段起始步驟和細胞因子加重過敏性炎癥反應的中間階段)可能會產生比較好的效果。TNF-α屬于原炎癥因子，既是過敏性鼻炎的炎性因子，也能刺激多種細胞產生炎癥因子，促進嗜酸性粒細胞的浸潤。抗TNF-α抗體治療過敏性哮喘可以改善其炎癥反應，降低多種過敏性炎癥因子水平〔13〕。

本研究結果發現抗TNF-α IgY滴鼻能夠改善過敏性鼻炎老年大鼠的臨床癥狀，減輕炎癥反應。Guo-Zhu等〔14〕研究發現抗TNF-α IgY能夠改善過敏性鼻炎的癥狀和炎癥反應，本研究與其研究結果一致。IgE能夠促進組胺、TNF-α等多種細胞因子的釋放，引起打噴嚏、流涕、鼻癢等早期過敏反應，抗TNF-α IgY滴鼻能夠有效減輕IgE引起的早期過敏反應，減輕過敏性鼻炎的臨床癥狀。Th2細胞因子的增加引起晚期過敏反應，白細胞介素-4、白細胞介素-5、TNF-α、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等炎癥細胞和炎癥細胞因子增加，炎癥細胞浸潤，分泌黏液，加重炎癥病理反應，抗TNF-α IgY滴鼻能夠降低鼻灌洗液中的嗜酸性粒細胞含量，減輕鼻黏膜的炎癥反應和鼻黏膜中的嗜酸性粒細胞含量，減輕過敏性鼻炎的炎癥反應。綜上所述，抗TNF-α IgY滴鼻能夠改善老年過敏性鼻炎的臨床癥狀，減輕炎癥反應，為老年過敏性鼻炎的治療提供了新的思路。

1Spinozzi F,Murgia N,Baldacci S,etal.Characteristics and predictors of allergic rhinitis undertreatment in primary care〔J〕.Int J Immunopathol Pharmacol,2016;29(1):129-36.

2Hon KL,Fung CK,Leung AK,etal.Recent patents of complementary and alternative medicine for allergic rhinitis〔J〕.Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov,2015;9(2):107-19.

3Eloy P,Tobback L,Imschoot J.Rupatadine relieves allergic rhinitis:a prospective observational study〔J〕.B-ENT,2015;11(1):11-8.

4Murdoch RD,Bareille P,Ignar D,etal.Once-daily dosing of levocabastine has comparable efficacy to twice-daily dosing in the treatmentof allergic rhinitis assessed in an allergen challenge chamber〔J〕.Int J Clin Pharmacol Ther,2015;53(10):811-8.

5秦 樂,曾 強,歐云娜,等.過敏性鼻炎的治療進展〔J〕.中藥與臨床,2014;5(4):50-5.

6Zhang N,Li H,Jia J,etal.Anti-inflammatory effect of curcumin on mast cell-mediated allergic responses in ovalbumin-inducedallergic rhinitis mouse〔J〕.Cell Immunol,2015;298(1-2):88-95.

7Incorvaia C,Mauro M,Ridolo E.Sublingual immunotherapy for allergic rhinitis:where are we now 〔J〕?Immunotherapy,2015;7(10):1105-10.

8Stuck BA,Hummel T.Olfaction in allergic rhinitis:a systematic review〔J〕.J Allergy Clin Immunol,2015;136(6):1460-70.

9Meltzer EO,Ratner PH,McGraw T.Oral Phenylephrine HCl for nasal congestion in seasonal allergic rhinitis:a randomized,open-label,placebo-controlled study〔J〕.J Allergy Clin Immunol Pract,2015;3(5):702-8.

10Kim BY,Park HR,Jeong HG,etal.Berberine reduce allergic inflammation in a house dust mite allergic rhinitis mouse model〔J〕.Rhinology,2015;53(4):353-8.

11Ku JM,Hong SH,Kim SR,etal.Anti-allergic effects of So-Cheong-Ryong-Tang in ovalbumin-induced allergic rhinitis model〔J〕.Eur Arch Otorhinolaryngol,2016;273(1):123-31.

12Quan SH,Zhang YL,Han DH,etal.Contribution of interleukin 17A to the development and regulation of allergic inflammation in a murine allergic rhinitis model〔J〕.Ann Allergy Asthma Immunol,2012;108(5):342-50.

13涂 威,向 勤,胡微煦,等.抗IL-1β和TNF-α IgY抗體治療老年大鼠過敏性支氣管哮喘的機制〔J〕.中國免疫學雜志,2014;30(7):893-7.

14Guo-Zhu H,Xi-Ling Z,Zhu W,etal.Therapeutic potential of combined anti-IL-1β IgY and anti-TNF-α IgY in guinea pigs with allergic rhinitis induced by ovalbumin〔J〕.Int Immunopharmacol,2015;25(1):155-61.