抗TNF-α IgY滴鼻對老年大鼠過敏性鼻炎的治療作用

董金輝 任秀敏 王建星 徐 鷗

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北 石家莊 050000)

過敏性鼻炎是一種變應(yīng)性鼻炎，隨著大氣環(huán)境的改變，其發(fā)生率不斷提高，有從季節(jié)性向常年性轉(zhuǎn)變的傾向，對人們的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響〔1～3〕。過敏性鼻炎主要采用藥物治療〔4,5〕。其中糖皮質(zhì)激素能夠抑制免疫反應(yīng)，但長時間應(yīng)用副作用比較大，甚至出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象；抗組胺藥物等炎癥介質(zhì)抑制劑只能緩解癥狀，且費(fèi)用比較高，副作用大。腫瘤壞死因子(TNF)-α為過敏性鼻炎的炎癥因子，也能夠刺激平滑肌、氣道上皮、免疫活性細(xì)胞等產(chǎn)生多種炎癥因子，對嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤有促進(jìn)作用〔6〕。本研究對過敏性鼻炎模型老年大鼠給予抗TNF-α免疫球蛋白(Ig)Y滴鼻治療，探討其對老年大鼠過敏性鼻炎的治療效果。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 清潔級、雌雄不限、20～22月齡、體重350～410 g的老年大鼠28只，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK(粵)2006-0012，實(shí)驗(yàn)經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2主要試劑和儀器 非特異性IgY、抗TNF-α IgY、雞卵清蛋白、氫氧化鋁凝膠(美國sigma公司)等；顯微鏡(德國Leica公司)、離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)等。

1.3建模及分組 建立老年大鼠過敏性鼻炎模型并隨機(jī)分為4組：A組(正常對照組)、B組(模型組)、C組(非特異性IgY治療組)和D組(抗TNF-α IgY治療組)，B、C、D組均建立過敏性鼻炎動物模型。基礎(chǔ)致敏：將0.3 mg卵清蛋白、30 mg氫氧化鋁粉末和生理鹽水1 ml制成混懸溶液，每只大鼠隔日1次腹腔注射，共注射7次；然后用2.0%卵清蛋白滴鼻激發(fā)，1次/d，每次每側(cè)鼻孔0.1 ml；第4天時，B組給予生理鹽水0.1 ml滴鼻、C組給予非特異性IgY 0.1 ml滴鼻、D組給予抗TNF-α IgY 0.1 ml滴鼻后，均再給予2.0%卵清蛋白滴鼻激發(fā)，共7 d。A組在其余3組基礎(chǔ)免疫及激發(fā)(加強(qiáng)免疫)時均給予0.1 ml生理鹽水滴鼻。

1.4癥狀分級評分 每次激發(fā)后觀察半小時，觀察老年大鼠的噴嚏次數(shù)、流涕程度和鼻癢等，每一癥狀根據(jù)嚴(yán)重程度分為1～3分:打噴嚏：1分為打噴嚏1～3個，2分為打噴嚏4～10個，3分為打噴嚏11個及以上；流鼻涕：1分為流至前閉孔，2分為流涕超過前閉孔，3分為流涕滿面；抓鼻：1分為輕抓鼻1～2次，3分為劇烈抓鼻，2分介于1分和3分之間；總分5分以上為過敏性鼻炎建模成功。上述老年大鼠癥狀積分均在5分以上，均建模成功。分別記錄激發(fā)第4天治療前和治療結(jié)束后各組老年大鼠的癥狀積分情況。

1.5鼻黏膜蘇木素-伊紅(HE)染色 處死各組老年大鼠，分離老年大鼠鼻黏膜，甲醛固定，鹽酸甲醛脫鈣，取鼻黏膜中段，進(jìn)行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察HE染色情況。

1.6鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) 每只老年大鼠鼻黏膜切片取8個區(qū)域，計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞所占比例，取平均值。

1.7鼻灌洗液中炎癥細(xì)胞含量測定 老年大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，取仰臥頭低位，從一側(cè)鼻腔中緩慢滴入磷酸鹽緩沖液(PBS)，移液槍在對側(cè)鼻腔中抽吸，置于EP管中，將各組鼻灌洗液細(xì)胞涂片，加入瑞氏吉姆薩染液染色，PBS沖洗，晾干后高倍鏡下計(jì)數(shù)500個炎癥細(xì)胞并計(jì)算百分比。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件，多組均數(shù)比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩均數(shù)比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組治療前后癥狀積分比較 治療前，B組、C組和D組癥狀積分均顯著高于A組(P<0.05)；治療后,B組和C組癥狀積分顯著高于A組和D組(P<0.05)，A組和D組癥狀積分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；組內(nèi)比較:D組治療后癥狀積分低于治療前(P<0.05)，A、B、C組治療前后比較癥狀積分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組治療前后癥狀積分比較

與A組比較:1)P<0.05；與B組比較:2)P<0.05；與C組比較:3)P<0.05；下表同

2.2各組鼻黏膜HE染色情況 A組鼻黏膜偶見淋巴細(xì)胞浸潤；B組和C組鼻黏膜水腫，見固有層和上皮層有大量淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，有上皮細(xì)胞脫落，血管中見炎性細(xì)胞浸潤；D組鼻黏膜輕度水腫，上皮層和固有層有少量淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，上皮比較完整。見圖1。

圖1 各組鼻黏膜HE染色(×200)

2.3各組鼻黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞的變化情況 與A組〔(0.59±0.27)%〕比較，B組、C組和D組鼻黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞所占比例均升高〔(12.53±2.12)%，(11.76±1.87)%，(6.97±1.64)%，均P<0.05〕；與B組和C組比較，D組鼻黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞所占比例下降(P<0.05)；B組和C組鼻比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4各組老年大鼠鼻灌洗液中炎癥細(xì)胞比較 與A組比較，B、C、D組鼻灌洗液中淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞含量顯著升高(P<0.05)，巨噬細(xì)胞含量顯著降低(P<0.05)；與B組和C組比較，D組鼻灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞含量顯著降低(P<0.05)，巨噬細(xì)胞含量顯著升高(P<0.05)；B組和C組鼻灌洗液中各炎癥細(xì)胞含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組鼻灌洗液中炎癥細(xì)胞比較

3 討 論

過敏性鼻炎的特點(diǎn)為IgE抗體和嗜酸性粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞上的受體結(jié)合，使嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞釋放組胺、白三烯、血管內(nèi)皮生長因子、TNF-α等多種化學(xué)物質(zhì)及炎性因子，促進(jìn)組織水腫、血管擴(kuò)張、流涕、打噴嚏、鼻癢及氣道高反應(yīng)等過敏反應(yīng)癥狀和體征〔7,8〕；隨后出現(xiàn)晚期過敏反應(yīng)，其為Th2細(xì)胞因子依賴性的，表現(xiàn)為TNF-α、白細(xì)胞介素(ILs)、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞和細(xì)胞因子升高，分泌黏液，引起炎癥性病理變化〔9,10〕。過敏性鼻炎IgE抗體作用引起的早期過敏反應(yīng)產(chǎn)生的TNF-α等原炎性因子能夠刺激Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5等Th2細(xì)胞因子，鼻黏膜上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α等原炎癥因子和IL-6、IL-8等炎癥因子，增加內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞黏附分子-1、細(xì)胞間黏附分子-1和血管細(xì)胞黏附分子-1等的表達(dá)，加重氣道的高反應(yīng)性，加重過敏性鼻炎的炎癥改變〔11〕；同時抑制Th1細(xì)胞因子的分泌，引起Th1/Th2細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的平衡失調(diào)，引起炎癥細(xì)胞在鼻黏膜的聚集、增殖和活化〔12〕。

在免疫反應(yīng)過程中，分為抗原識別、免疫細(xì)胞反應(yīng)和免疫效應(yīng)3個階段，在免疫激活極端，抗原難以準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)，特異性免疫治療應(yīng)用范圍有限；在免疫細(xì)胞反應(yīng)階段，免疫反應(yīng)自動完成，只有化療藥物抑制細(xì)胞周期能夠發(fā)揮作用，其他藥物基本沒有效果；在免疫效應(yīng)階段，相應(yīng)的抗體(IgE抗體等)效果也不穩(wěn)定。阻斷原炎癥因子反應(yīng)階段(即效應(yīng)階段起始步驟和細(xì)胞因子加重過敏性炎癥反應(yīng)的中間階段)可能會產(chǎn)生比較好的效果。TNF-α屬于原炎癥因子，既是過敏性鼻炎的炎性因子，也能刺激多種細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤。抗TNF-α抗體治療過敏性哮喘可以改善其炎癥反應(yīng)，降低多種過敏性炎癥因子水平〔13〕。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗TNF-α IgY滴鼻能夠改善過敏性鼻炎老年大鼠的臨床癥狀，減輕炎癥反應(yīng)。Guo-Zhu等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)抗TNF-α IgY能夠改善過敏性鼻炎的癥狀和炎癥反應(yīng)，本研究與其研究結(jié)果一致。IgE能夠促進(jìn)組胺、TNF-α等多種細(xì)胞因子的釋放，引起打噴嚏、流涕、鼻癢等早期過敏反應(yīng)，抗TNF-α IgY滴鼻能夠有效減輕IgE引起的早期過敏反應(yīng)，減輕過敏性鼻炎的臨床癥狀。Th2細(xì)胞因子的增加引起晚期過敏反應(yīng)，白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-5、TNF-α、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞和炎癥細(xì)胞因子增加，炎癥細(xì)胞浸潤，分泌黏液，加重炎癥病理反應(yīng)，抗TNF-α IgY滴鼻能夠降低鼻灌洗液中的嗜酸性粒細(xì)胞含量，減輕鼻黏膜的炎癥反應(yīng)和鼻黏膜中的嗜酸性粒細(xì)胞含量，減輕過敏性鼻炎的炎癥反應(yīng)。綜上所述，抗TNF-α IgY滴鼻能夠改善老年過敏性鼻炎的臨床癥狀，減輕炎癥反應(yīng)，為老年過敏性鼻炎的治療提供了新的思路。

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