復方藜芍片通過阻斷JAK2/STAT3通路抑制皮層神經炎癥改善硝酸甘油致大鼠慢性偏頭痛＊

楊建梅，鄧海燕，李 坤，王星禹，陳 雷，李佳維，汝 蕓，顧政平，徐 穎＊＊

（1.上海市徐匯區中心醫院 上海 200031；2.上海中醫藥大學康復醫學院 上海 201203;3.上海中醫藥大學生理教研室 上海 201203;4.中國科學院科學出版社 北京 100864）

1 前言

慢性偏頭痛（chronicmigraine）是臨床常見的原發性頭痛，根據國際頭痛協會最新發布的國際頭痛分類和診斷標準Ⅲ試用版（ICHD-3beta版）慢性偏頭痛診斷標準：頭痛≥15天/月，至少持續3個月，頭痛持續時間≥4小時/天，其中每月至少8次的頭痛等臨床癥狀[1]。在中國慢性偏頭痛的患病率很高[2]，其發作不僅影響患者工作效率及生活質量，還給患者家庭帶來沉重的經濟負擔[3]。目前臨床上偏頭痛特異性治療西藥包括麥角類制劑和曲普坦類，預防性治療西藥包括鈣離子拮抗劑、抗癲癇藥、抗抑郁藥和5-HT受體拮抗劑等。這些藥物雖然療效顯著，但是副作用較大，不能長期服用。如長期服用麥角類和曲普坦類藥物會引起惡心、嘔吐、心悸、煩躁等癥狀[4]。中醫治療頭痛有其獨特的理論和顯著的療效，且中藥方劑毒副作用也小于西藥。復方藜芍片是由上海市徐匯區中心醫院研制，其主要中藥包括：白芍、葛根、白蒺藜、丹參、白菊等，具有平肝潛陽、活血化瘀、鎮痛鎮靜、解痙的作用，在臨床應用多年，能明顯緩解偏頭痛疼痛程度和減少發作次數[5-6]。既往復方藜芍片曾命名為“顱痛飲”或“顱痛片”，按照《中國藥品通用名稱命名原則》，采用處方主要藥材名稱的縮寫并結合劑型命名方法，因本品為復方制劑，“藜”是取主要藥味“白蒺藜”，“芍”是取主要藥味“白芍”，劑型為片劑，故命名為“復方藜芍片”。本研究目的在于觀察復方藜芍片對慢性偏頭痛大鼠皮層炎癥、疼痛相關蛋白及JAK2/STAT3通路的調節作用，并探討復方藜芍片改善慢性偏頭痛的藥理作用靶點，為其臨床治療提供科學依據。

2 材料

2.1 實驗動物

60只SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠，體重200-220 g左右，上海中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005，實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2014-0008。動物自由攝食飲水，飼養在室溫（21±2℃），濕度（45%-65%）和明暗交替（12 h：12 h）環境中，實驗操作均嚴格按照實驗動物倫理學相關規則進行，經上海中醫藥大學動物倫理委員會批準（審批號：SZY 201707015）。

2.2 主要試劑和儀器

復方藜芍片（批號：1703）由上海市徐匯區中心醫院研制，上海百歲行藥業有限公司生成；西比靈（批號：170313373）購自西安楊森制藥有限公司；硝酸甘油注射液（批號：20161016）購自北京益民藥業有限公司；anti-iNOS鼠單克隆抗體（批號：I0117）、anti-COX-2鼠單克隆抗體（批號：J2617）、anti-CGRP鼠單克隆抗體（批號：G1916）、anti-c-Fos鼠單克隆抗體（批號：L1916）、anti-JAK2鼠單克隆抗體（批號：D1216）、anti-STAT3鼠單克隆抗體（批號：C1317）、anti-p-STAT3鼠單克隆抗體（批號：G0816）、Anti-rabbit IgG（批號：09/2017）、Anti-mouse IgG（批號：08/2017）均購自 Santa Cruz Biotechnology公司；anti-p-JAK2兔單克隆抗體（批號：10/2017）購自Cell Signaling Technology公司；RIPA裂解液（批號：090717170930）購自碧云天生物技術公司；BSA（批號：6531010160）購自Geenview公司；Rat IL-1β ELISA KIT（批號：201710）購自美國RD公司；ECL顯影液（批號：SD246946）購自Thermo Scientific公司；Rat TNF-α ELISA Set（批號：7192819EU）購自BD Pharmingen公司；電泳儀（美國BIO RAD，型號：BR90518）；全自動凝膠成像系統（上海天能公司，型號：Tanon-2500）；酶標儀（美國Bio-Tek，型號：Synergy2）。

3 實驗方法

3.1 藥物備制

復方藜芍片根據藥品說明書顯示：60 kg體重的成人每日用藥8.4 g。根據“人體/動物體表面積計算法”換算，分別設低劑量（420mg·kg-1）、中劑量（840mg·kg-1），和高劑量（1680 mg·kg-1）。相同方法計算大鼠西比靈用量為1 mg·kg-1。復方藜芍片和西比靈分別用生理鹽水溶解，配置好后冷藏于4℃冰箱備用。

3.2 動物分組及給藥治療

60只SD雄性大鼠，按隨機數字表法分為6組：正常組（Control,n=10）、偏頭痛組（Migraine,n=10）、復方藜芍片低劑量組（FFLSP-L，n=10）、中劑量組（FFLSPM,n=10）、高劑量組（FFLSP-H,n=10）和西比靈組（FH,n=10）。FFLSP-L、FFLSP-M、FFLSP-H組大鼠分別給予不同劑量的復方藜芍片溶液灌胃；FH組給予西比靈溶液灌胃；Control組、Migraine組分別給予等量生理鹽水灌胃。各組灌胃均為每日1次，連續30天，灌胃容積均為0.1 mL·kg-1。

3.3 模型制備及標本處理

慢性偏頭痛模型制作依據文獻[7]，采用大鼠頸部皮下注射硝酸甘油溶液（10 mg·kg-1），每3日1次，共5次，造模時間為分別在各組大鼠給藥治療后的第18、21、24、27、30天，Migraine、FFLSP-L、FFLSP-M、FFLSPH組均需制備偏頭痛模型，Control組大鼠頸部皮下注射等體積的生理鹽水。造模成功的標志為注射硝酸甘油后的5 min左右，大鼠開始出現雙耳發紅、前肢頻繁搔頭、爬籠次數增多、煩躁不安等現象。最后一次造模24 h后處死大鼠，斷頭取腦后于冰上分離皮層并置于凍存管中，在液氮中迅速冷凍后轉移至-80℃冰箱冷凍保存備用。

3.4 Western blot檢測皮層蛋白表達

圖1 復方藜芍片對慢性偏頭痛大鼠皮層c-Fos、CGRP蛋白表達的影響

將皮層從凍存管中取出，加入裂解液（RIPA、PMSF、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑，按100∶1∶1∶1的比例混合）于組織研磨儀中勻漿，4℃低溫離心后取上清進行蛋白定量，將樣品蛋白含量定為40 μg?μL-1進行上樣。具體步驟如下：①配置10%SDS-PAGE凝膠（濃縮膠：超純水2.1 mL；30%丙烯酰胺0.5 mL；pH 8.8 0.38 mL；10%SDS 0.03 mL；10%Aps 0.03 mL；TEMED 5 μL。分離膠：超純水4.1mL；30%丙烯酰胺3.3mL；PH8.82.5mL；10%SDS 0.1 mL；10%Aps 0.1 mL；TEMED 10 μL）。②每孔上樣10 μL。③60V電壓電泳30 min，再80 V電壓電泳30 min，110 V電壓電泳直至結束。④110 V電壓，4℃，轉膜120 min。⑤5%脫脂奶粉或者5%BSA室溫封閉1 h。⑥4℃孵育一抗過夜（分別孵育iNOS、COX-2、CGRP、c-Fos、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 抗體）。⑦TBST洗膜（10 min×3次，室溫）。室溫孵育二抗1 h。再次TBST洗膜（10 min×3次，室溫）后均勻涂抹ECL顯色劑進行曝光。

3.5 酶聯免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測皮層IL-1β、TNF-α含量

將皮層從凍存管中取出，加入200 mL 9%NaCl于組織研磨儀中勻漿，4℃低溫離心后取上清進行蛋白定量。①1∶250稀釋一抗后，100 μL/孔上樣，4℃靜置過夜（≥16 h）。②洗板，300 μL/孔×5次。③室溫封閉1 h，洗板。④100 μL/孔的樣本和標準品進行加樣后，室溫靜置2 h，洗板。⑤1‥250稀釋detection antibody后，100 μL/孔上樣，室溫靜置1 h，洗板。⑥1∶250稀釋Enzyme Reagent，100 μL/孔上樣，室溫靜置 30 min，洗板。⑦100 μL/孔底物緩沖液，室溫避光反應30 min。100 μL/孔終止液終止反應后，450 nm波長測OD值。

3.6 統計學方法

實驗數據均使用平均值±標準誤（Mean±SEM）表示，實驗數據用SPSS18.0軟件分析。多組間相比較采用One-way ANOVA分析方法，多重比較用LSD檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 復方藜芍片降低慢性偏頭痛大鼠皮層c-Fos、CGRP的蛋白表達

Western blot檢測各組大鼠皮層疼痛相關蛋白c-Fos和CGRP蛋白表達。與Control組比較，Migraine組大鼠皮層c-Fos和CGRP蛋白表達明顯增高（P＜0.01）。與Migraine組比較，FFLSP-L、FFLSP-M、FFLSP-H、FH各組c-Fos蛋白表達均明顯降低（P＜ 0.01）；與Migraine組比較，FFLSP-M、FFLSP-H、FH各組CGRP蛋白表達均明顯降低（P＜0.01）；FFLSP-L組CGRP蛋白表達與模型組差異無統計學意義（P＞0.05）（圖1）。

4.2 復方藜芍片降低慢性偏頭痛大鼠皮層iNOS、COX-2的蛋白表達

Western blot檢測大鼠皮層炎癥因子iNOS、COX-2蛋白表達。與Control組比較，Migraine組大鼠皮層iNOS和COX-2蛋白表達明顯增高（P＜0.01）。與Migraine組比較，FFLSP-L、FFLSP-M、FFLSP-H、FH各組iNOS和COX-2蛋白表達均明顯降低（P＜0.01）（圖2）。

4.3 復方藜芍片減少慢性偏頭痛大鼠皮層IL-1β、TNF-α的水平

ELISA檢測各組大鼠皮層IL-1β和TNF-α的水平，與Control組比較，Migraine組大鼠皮層IL-1β和TNF-α水平明顯增高（P＜ 0.05）。與Migraine組比較，FFLSP-M、FFLSP-H、FH各組IL-1β水平均明顯降低（P ＜ 0.01），FFLSP-L組IL-1β水平無明顯差異；與Migraine組比較，FFLSP-L、FFLSP-M、FFLSP-H、FH各組TNF-α水平均明顯降低（P＜0.05;P＜0.01）（圖3）。

圖2 復方藜芍片對慢性偏頭痛大鼠皮層iNOS、COX-2蛋白表達的影響

圖3 復方藜芍片對慢性偏頭痛大鼠皮層IL-1β、TNF-α含量的影響

圖4 復方藜芍片對慢性偏頭痛大鼠皮層JAK2/STAT3信號通路的影響

4.4 復方藜芍片阻斷偏頭痛大鼠皮層JAK2/STAT3信號通路

Western blot檢測各組大鼠皮層p-STAT3和p-JAK2蛋白的磷酸化水平。與Contral組比較，Migraine組大鼠皮層p-STAT3和p-JAK2蛋白表達水平明顯增高（P ＜ 0.01）。與Migraine組比較，FFLSP-L、FFLSPM、FFLSP-H、FH各組p-STAT3和p-JAK2蛋白表達水平均明顯降低（P ＜ 0.01）（圖4）。

5 討論

偏頭痛是臨床常見的原發性頭痛，表現為發作性、搏動樣頭痛，常伴有惡心、嘔吐、畏光或畏聲，安靜環境或休息后可緩解[8]。偏頭痛病因復雜，發病機制目前尚不明確，關于其發病機制，主要存在以下幾種學說：神經源學說、血管源學說、三叉神經血管反射學說、皮層擴散性抑制學說、腦的興奮性假說及免疫因素等。其中較為公認的學說是三叉神經血管反射學說和皮層擴散性抑制學說。皮下或腹腔注射硝酸甘油溶液（10 mg·kg-1）已成為公認的偏頭痛模型，硝酸甘油作為脂溶性分子可通過血腦屏障后產生大量的NO，NO具有強烈的擴張腦血管作用，并具有神經毒性作用，導致神經源性炎癥反應，從而誘發偏頭痛。我們采用大鼠頸部皮下注射間斷多次注射硝酸甘油制作慢性偏頭痛模型，類似臨床的慢性偏頭痛癥狀[7]。

復方藜芍片是徐匯區中心醫院經過多年的臨床實踐中總結后擬出的治療偏頭痛（尤其是肝陽上亢型）的方藥，經過大量的臨床驗證證明復方藜芍片在縮短頭痛時間、預防頭痛發作方面優于其他中藥及西藥，而且無明顯毒副作用。復方藜芍片具有平肝潛陽、活血通絡之功。其組成包括：白芍、葛根、白蒺藜、生丹參、白菊花、鉤藤、珍珠母、蔓荊子、白芷、薄荷。方中白芍、葛根為君藥，白芍柔肝止痛、平肝潛陽；葛根解肌退熱，活血化淤，升引諸藥上達頭目。白蒺藜、丹參、珍珠母、鉤藤、白菊花為臣藥。白蒺藜平肝潛陽、舒肝解郁；丹參活血祛瘀；珍珠平肝潛陽，安神明目；鉤藤清肝熱，平熄肝風，有解痙之功；菊花疏散風熱，清熱解毒，平肝潛陽。佐以蔓荊子、白芷，蔓荊子散風熱，清頭目；白芷祛風散寒，通竅止痛。使藥薄荷疏風清熱，清利頭目，善治頭風頭痛。諸藥配合，具平肝潛陽、活血通絡之功，有鎮痛、鎮靜、解痙、擴張血管之效。有研究發現葛根主要成分葛根總黃酮能夠明顯改善利血平所致偏頭痛癥狀[9]。其他研究發現白芍能夠通過降低IL-1β、TNF-α，發揮抗炎作用[10]。研究發現菊花可以抑制環氧酶代謝途徑，減少PGE2炎癥介質的釋放達到抗炎的目的[11]。這些研究都為復方藜芍片治療偏頭痛提供了一定的科學基礎。

c-Fos原癌基因（cellular oncogene fos，c-Fos）屬于即刻早基因。生理狀態下，c-fos在中樞神經系統的表達很低，不易檢測。當受到刺激的時候，在數分鐘內會高水平表達，參與疼痛的控制[12]。降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptid，CGRP）是目前發現的最強大的血管舒張肽，CGRP在三叉神經系統中廣泛表達，三叉神經系統興奮時會釋放大量CGRP，進而活化CGRP受體，擴張顱內血管，特別是硬腦膜血管，引起神經源性炎癥的發生，產生頭痛[13]。Deepak Kumar Bhatt等[14]通過在大鼠側腦室注射CGRP以觀察c-fos活化情況，發現在CGRP注射后的2 h，大鼠腦干外層，即神經膠質細胞和軟腦膜中的c-fos表達增加，表明CGRP的高表達可能會激活c-fos基因。誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）在巨噬細胞、中性粒細胞、內皮細胞和血管平滑肌等細胞中表達，IFN-γ、IL-6、NK-KB等細胞因子可誘導iNOS表達，催化產生NO引起炎癥和疼痛反應。環氧合酶2（cycloxygenase 2，COX 2）是炎癥過程中重要的誘導酶，可以被多種細胞因子誘導，能夠促進前列腺素的生成[15]。JAK2/STAT3信號通路是多種細胞因子和生長因子在細胞內傳遞信號的途徑，在生長發育過程中必不可少，但JAK2/STAT3通路的激活在炎癥性疾病過程中也起著重要的調控作用。JAK2/STAT3的基本傳遞過程如下：細胞因子與受體結合后形成同型二聚體復合物，這種受體信號轉導復合物的形成使得JAK2家族激酶相互接近發生反式磷酸化，并隨后活化受體上的特定酪氨酸殘基作為STAT3的停靠點，活化后的STAT3在胞質中形成同型二聚體，隨后移位至細胞核促進相應的基因轉錄和表達[16,17]。

本次研究發現模型組大鼠皮層的促炎因子iNOS、COX-2、IL-1β、TNF-α，以及疼痛相關蛋白CGRP、c-Fos明顯高于正常組，這與既往研究相一致，證明硝酸甘油一方面能刺激機體產生大量的IL-1β、TNF-α，誘導iNOS、COX-2表達引起炎癥反應，從而引發頭痛的發生；另一方面，硝酸甘油能夠直接刺激皮層CGRP高表達，CGRP作為一種強大的內源性血管神經肽，能夠刺激血管擴張，使頭痛產生。與模型組比較，復方藜芍片中、高劑量能明顯減少iNOS、COX-2、IL-1β、TNF-α、CGRP、c-Fos、p-JAK2、p-STAT3的表達。推測復方藜芍片的治療作用可能從以下兩個方面減輕頭痛：①復方藜芍片能通過抑制JAK2/STAT3信號通路，減少IL-1β、TNF-α等炎癥因子，降低iNOS、COX-2的表達，減輕由炎癥所致的頭痛。②復方藜芍片可以降低CGRP、c-Fos，抑制血管擴張，直接或間接減輕疼痛反應。綜上所述，復方藜芍片中、高劑量能夠明顯減緩偏頭痛，其機制可能是通過抑制JAK2/STAT3信號通路，減輕炎癥反應，從而達到治療慢性偏頭痛的目的。