miR-34a通過下調SIRT1抑制乳腺癌干細胞機制研究*

李曉鋒,汪園園，劉 希

西安交通大學第一附屬醫院病理科(西安710061)

乳腺癌對女性的傷害非常大，近年來乳腺癌的發生率一直在增加，對患者的生命造成了很大的壓力[1]。在臨床上乳腺癌的患者出現乳房腫塊、胸痛、水腫、乳頭內陷、乳頭溢液以及乳頭破碎等情況[2]，嚴重影響患者的生活質量和生命安全。miR-34a是一種腫瘤抑制因子，根據現在的研究發現miR-34a能夠在胰腺癌干細胞，胃癌干細胞中發揮作用，但是在乳腺癌中是否能夠發揮作用并不確定[3]。為了研究miR-34a通過下調SIRT1抑制乳腺癌干細胞的機制研究，本文中通過合成miR-34a的mimics或者inhibitors，并制成慢病毒的載體，從而改變SIRT1的蛋白質的表達，達到抑制乳腺癌細胞發展的作用。

材料與方法

1 材 料

1.1 質粒，細胞系，病毒：其中慢病毒載體，質粒均是從 Genepharma公司購買的，人乳腺癌細胞株MCF細胞是本實驗中保存的。

1.2 實驗儀器和器材： 其中有CO2培養箱(Thermo公司)，超凈工作臺，Mx300P熒光PCR儀(吉泰生物科技有效公司)，PCR管，8聯排PCR管(Axygen公司)。

1.3 實驗試劑：使用的實驗試劑(限制性內切酶，Hsa-miR-mimics，Hsa-miR-inhibitors等)均由Inwitrogen公司購買。

2 方 法

2.1 MCF-7的細胞培養：將冷凍封存在MCF-7細胞放入恒溫水浴箱中，使其融化，離心，放入培養基中，放入CO2培養箱中，每隔2～3 d更換一次培養基。將對數生長期的細胞取出，并制成單細胞懸液。離心后去掉上清液，重新制成懸浮細胞，將細胞懸液放置在培養瓶中，放在CO2培養箱中培養。

2.2 miR-34a的mimics或者inhibitors轉染MCF-7細胞：將干粉miR-34a的mimics或者inhibitors以及NC溶解于DEPC水中，嚴格按照說明書進行轉染。

2.3 構建穩定的miR-34a的慢病毒載體：使miR-34a的基因片段獲得引物，并實行PCR擴增，對擴增的產物進行酶切。將PCR的產物連接線性化的質粒，制成感受態的細胞，之后實行轉化。將其中的陽性克隆挑選出來，并進行PCR測定，之后進行測序。本實驗中共轉染293T的細胞，并且獲得濃縮的病毒，實行滴定測定。

2.4 miR-34a的慢病毒載體感染MCF-7細胞：取出對數生長期的MCF-7細胞鋪平放在孔板中，分別將0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2μg/ml的濃度放置在孔板中，每2天更換新的培養液，使用顯微鏡觀察細胞的死亡的情況，取出1周后完全死亡的濃度為最低的抑制濃度。根據說明書確定感染的最佳復數和感染的條件。使用miR-34a的慢病毒載體大量感染MCF-7細胞，感染后24h加入最低的抑制濃度0.4μg/ml的puromycin。收獲具有抗性的細胞并提取RNA鑒定。

2.5 shRNA-SIRT1的表達載體的建立：在人的SIRT1的基因序列中選取4個位點，分別設計shRNA。將shRNA模板實行退火，設置出shRNA-SIRT1-1，shRNA-SIRT1-2，shRNA-SIRT1-3，shRNA-SIRT1-4，shRNA-NC，shRNA-GAPDH。將pGPH1/GFP/Neo載體進行線性化，構建pGPH1/GFP/Neo-shRNA載體。每組中選取兩個克隆委托上海英駿生物有效公司進行測序。

2.6 shRNA-SIRT1載體轉染MCF-7細胞：將G418的最低的抑制濃度篩選出來，在轉染前1 d，將對數生長期中細胞接種在培養基(不含抗生素)中。取SIRT1質粒(4μg)，放入培養基(250μl Opti-MEMI)中，取lipofectamine2000(4μg)放入培養基(250μl Opti-MEMI)中，將上兩步中的結果混合，放置在溫室中孵育。將轉染的混合液放入各孔中，放置在CO2培養箱中，使用具有抗生素抗性的細胞繼續使用含有G418的培養基培養。獲得細胞RNA和蛋白質。

3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件，計量資料采用(均數±標準差)的方式表示，兩組間的比較采用t檢驗，治療前后數據的比較采用配對t檢驗;計數資料采用頻數和百分比表示，組間差異采用χ2檢驗，認為P<0．05時，差異具有統計學意義。

結 果

通過miR-34a的mimics轉染的細胞的miR-34a的基因的表達水平大于沒有轉染的細胞，通過miR-34a的inhibitors轉染的細胞的miR-34a的基因的表達水平小于沒有轉染的細胞，差異具有統計學意義(P<0.05)。LV-miR-34a感染細胞可以上調miR-34a的表達，與沒有轉染的細胞相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。shRNA-SIRT1-3組和shRNA-SIRT1-4組中的SIRT1中的mRNA和蛋白的表達出現下降的情況。過表達的miR-34a對SIRT1中的mRNA的表達沒有影響。miR-34a的mimics具有抑制SIRT1的蛋白表達的作用，miR-34a的inhibitors具有上調SIRT1的蛋白表達的作用，與沒有轉染的乳腺癌的MCF-7的細胞相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。模擬物與抑制劑對miR-34a的基因表達的作用，在mimics轉染的細胞中表達為20±2.5，在inhibitors轉染的細胞表達為0.51±0.31，沒有轉染的細胞為正常表達水平1.0。

討 論

現在隨著分子生物學的快速發展，人們已經認識到腫瘤是與基因相關的一種疾病。癌基因的激活與抑癌基因的一個失活均可以導致細胞能夠更好地逃避機體的調控，出現細胞的增殖異常、凋亡、侵襲與轉移增強等一些現象。乳腺癌在女性中是一種常見的惡性腫瘤，目前隨著臨床診療技術的提高，早期的一個手術切除結合放療與化療的手段能幫助大部分乳腺癌病人取得了比較好的臨床治療效果。女性腫瘤中乳腺癌還是死亡的主要原因，一旦腫瘤發生轉移，患者的預后比較差[4]。 miRNA是一種小分子的非編碼的RNA，根據研究發現，miRNA是一種生物學的標記，可以應用于靶向的腫瘤治療[5]。miRNA的活性與其和靶基因miRNA的可結合性密切相關，針對靶基因的不同序列，miRNA的抑制作用差異很大[6]。miR-34a廣泛存在各種真核生物中，miR-34a在細胞中起到誘導細胞周期阻滯、抑制細胞侵襲轉移和促進細胞衰老等多種功能。研究顯示miR-34a是p53的直接靶基因，過表達的miR-34a可以誘導細胞出現凋亡以及細胞周期的停滯[7]。因此，miR-34a可以抑制腫瘤的基因的表達。在結腸癌中，miR-34a可以通過調控SIRT1的表達從而促進腫瘤細胞的凋亡[8]?，F在可以通過模擬物以及抑制劑控制miR-34a的表達，通過慢病毒的載體攜帶miR-34a基因感染細胞，從而導致miR-34a基因在細胞中表達[9]。病毒中的miR-34a基因可以隨著細胞的復制而復制，從而在細胞中穩定的表達。鞏雅寧等[10]研究的人乳腺癌組織中miR-34a的表達及其在乳腺癌細胞系中的功能研究的研究結果與本文結果具有一致性，說明本文研究結果具有一定的可信性。

本研究miR-34a通過下調SIRT1抑制乳腺癌干細胞的機制，使用化學合成的方法合成出miR-34a的mimics或者inhibitors，將其感染乳腺癌的MCF-7的細胞[11]，通過qRT-PCR的方法驗證miR-34a的基因的表達。以慢病毒作為載體過表達miR-34a的基因，將能夠穩定感染的細胞株篩選出來。設計SIRI1基因中的shRNA,用于干擾乳腺癌的MCF-7的細胞中的SIRT1的表達[12]。使用qRT-PCR方法和Western blotting技術檢測SIRT1中的mRNA和蛋白的表達。

綜上所述，使用miR-34a的模擬物以及抑制物可以調節miR-34a的表達，從而改變SIRT1的蛋白質的表達，其中shRNA-SIRT1-3，shRNA-SIRT1-4具有良好的干擾效果。

[1] 曾 葉,周子楦,孫 遜，等.PEG可脫除材料修飾miRNA納米粒的制備以及體內外性質的考察[J].中國藥科大學學報,2016,47(6):702-707.

[2] 李秀娟,趙建華,唐金海，等.miR-34a可能靶向Notch1影響乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性[J].中華腫瘤雜志,2014,36(12):892-896.

[3] 馮 剛,劉志蘇.微小RNA-34a在乳腺癌組織的表達及其對乳腺癌細胞的生物學影響[J].中華實驗外科雜志,2016,33(11):2513-2515.

[4] 遲 婷,姜曉燕.乳腺癌組織中miR-34a與VEGF的關系及臨床意義[J].中國普通外科雜志,2016,25(5):680-685.

[5] 何 靜,楊 洋.MiR-34a對乳腺癌Mcf-7/ADR細胞株多柔比星敏感性影響研究[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20(24):1888-1891.

[6] 趙 矯，余 紅，趙小平，等.siRNA表迏載體對hTERT基因的效應評價[J].陜西醫學雜志，2009，38(1)：7-10.

[7] 李 瀚,李 彤,張利紅，等.乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/DOX中過表達miR-34c調節多柔比星敏感性的研究[J].海南醫學院學報,2016,22(7):636-638,642.

[8] 宋傳貴,吳雪英,傅芳萌，等.miR-34a與乳腺癌復發及預后的相關性研究[J].中華普通外科雜志,2012,27(12):1010-1013.

[9] Corinna E,Dieter FJ,Jenny Chang-C，etal.Deregulated serum concentrations of circulating cell-free micro RNAs miR-17, miR-34a, miR-155, and miR-373 in human breast cancer development and progression[J].Clinical Chemistry: Journal of the American Association for Clinical Chemists,2013,59(10):1489-1496.

[10] 鞏雅寧,劉為青,張 楠，等.人乳腺癌組織中miR-34a的表達及其在乳腺癌細胞系中的功能研究[J].腫瘤防治研究,2013,40(10):943-948.

[11] Zhao X,Duan Z,Liu X,etal.MicroRNA-127 is downregulated by tudor-SN protein and contributes to metastasis and proliferation in breast cancer cell line MDA-MB-231[J].The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology,2013,296(12):1842-1849.

[12] Rokavec M,Ner MG,Li H,etal.IL-6R/STAT3/miR-34a feedback loop promotes EMT-mediated colorectal cancer invasion and metastasis[J].The Journal of Clinical Investigation: The Official Journal of the American Society for Clinical Investigation,2014,124(4):1853-1867.