中醫證候的轉錄組學研究進展與探析＊

何浩強，陳 光，高嘉良，王 階＊＊

（1.中國中醫科學院廣安門醫院心血管科 北京 100053；2.北京中醫藥大學針灸推拿學院 北京 100029）

證候是中醫辨證論治的基礎與核心，是中醫理論的精粹部分。證候研究是中醫藥基礎研究、臨床實踐和現代化進程的關鍵一環。證候生物學基礎研究又是證候研究中必不可少的部分，也是證明中醫科學性的重要前提。目前，學者運用傳統中醫方法并結合現代科學技術，從整體、細胞、分子等多個層面，生理、生化、超微結構等多個方面對證候生物學基礎做了相關探索。尤其在進入后基因組時代之后，有學者[1]提出中西醫可能在尋找疾病的共性物質基礎時在基因水平上找到兩者的結合點，為證候生物學基礎研究進一步指明方向。目前證候生物學基礎研究[2]在分子層面的基本思路是以探索基因組、轉錄組、蛋白組表達異常及特異代謝組分，探尋證候物質基礎—“生物標志物群”為目的。其中，轉錄組是聯系基因組與蛋白組的樞紐。研究轉錄組不僅可以解讀基因組的功能元件，揭示細胞或組織的分子成分，也可以理解細胞、組織生長和疾病發展的過程[3]，同樣有利于解釋證候—中醫疾病發展過程中某一階段的病理概括—的發生發展機制。近年來，應用現代組學技術與方法，中醫證候在轉錄組學的研究取得一定進展，主要集中在轉錄組差異表達，轉錄組調控網絡兩個方面，為總結其經驗以促進證候轉錄組學的進一步研究，現對相關國內外文獻進行如下綜述。

1 轉錄組學內涵及研究方向

轉錄組學（Transcriptomics）是在整體水平上研究特定階段或生理狀態下某一細胞或組織所有基因轉錄情況及轉錄調控規律的一門學科[4]。狹義的轉錄組是指編碼蛋白質的信使RNA（messenger RNA，mRNA），廣義的轉錄組則是指從基因轉錄的RNA總和，包括mRNA和非編碼RNA（non-coding RNA,ncNRA）。研究顯示，人體超過93%的基因轉錄成RNA，其中只有2%轉錄成mRNA，其余為ncRNA[5]，ncRNA在基因調控中扮演重要的結構和功能角色。根據功能差異，ncRNA又可分為：①看家非編碼RNA，包括較熟悉的核糖體RNA、轉運RNA，以及小核RNA、小核仁RNA等；②調控性非編碼RNA，包括研究較多的微小RNA（microRNA，miRNA），長鏈非編碼RNA（long ncRNA，lncRNA），以及小干擾RNA，PIWI蛋白相互作用RNA等[6-8]。

轉錄組學研究的主要目的包括：對所有轉錄本進行分類；確定基因的轉錄結構，如起始位點，5′和3′端，剪接形式及其它轉錄后修飾等；量化細胞或組織在發育過程和不同情況下基因差異表達的水平。通過轉錄組分析，可以揭示基因表達與生命現象的內在聯系，對理解機體發育和病理生理機制具有重要作用[3]。目前，轉錄組研究已經成為揭示疾病的基因突變規律、疾病發生發展的重要機制、發現致病基因調控的關鍵靶點等領域的主要研究手段，廣泛應用于疾病預防、診斷、個性化治療和預后等領域[9]。在中醫藥領域，轉錄組學技術主要應用于證候學研究、中藥復雜體系研究、中藥材鑒別、以及中藥材活性成分生物合成和調控研究等方面[10]。在證候研究中，又以探索轉錄組能否成為證候診斷、分型、干預生物標志物可能性為主要內容。近期，有學者提出病證結合的生物標志物研究思路與方法，為中醫證候轉錄組研究提供了新的啟發[11]。

2 中醫證候轉錄組學研究的相關技術

2.1 基因芯片技術

基因芯片技術，又稱DNA微陣列技術，即通過將待測RNA片段逆轉錄成cDNA（complementary DNA），并用熒光標記，然后與芯片上已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定，最后通過檢測樣品熒光信號強弱測定基因表達水平的技術，包括寡核苷酸芯片、cDNA芯片[12]等。目前，該技術主要用于基因表達譜分析、基因突變及基因多態性表達譜分析、檢測可變剪接模式等[13,14]，在醫學領域則被用于疾病分類診斷，藥理毒理研究，藥物靶點篩選及藥效分析[15-17]。基因芯片技術發展較為成熟，具有高度平行性、高效性、自動化等特點，其優勢在于對基因表達水平估計快速準確，數據分析軟件及理論成熟[18]，但在新基因檢測與靈敏度上較測序技術差[19-21]。在證候轉錄組學研究方面，主要集中在分析不同證型間的差異基因表達水平，一般以mRNA、miRNA、lncRNA的差異表達為研究對象。

2.2 RNA測序技術

RNA測序技術，又稱RNA-seq技術，是將新一代高通量測序技術應用于RNA逆轉錄生成的cDNA上，從而獲得來自不同基因的RNA片段在特定樣本中的含量的技術，包括Solexa合成測序技術、454焦磷酸測序技術、SOLiD連接測序技術以及單分子測序技術等[22]，其過程是將RNA逆轉錄成cDNA文庫，將cDNA隨機剪切為小片段，在cDNA兩端加上接頭利用高通量測序儀測序，將獲得序列通過比對或從頭組裝形成全基因組范圍的轉錄譜[3]。目前，該技術主要用于基因表達譜分析、RNA結構及結構變異研究、非編碼區域功能研究和新基因發現等[23]，在生物學研究、臨床研究和藥物研究等領域被廣泛使用[3,24]。RNA-seq是測序技術飛速發展的新時代產物，具有數字化信號、高靈敏度、檢測范圍廣等特點，其優勢在于無需預先設計探針，可對任何物種進行全轉錄組分析，但因測序產生的海量數據尚缺乏成熟的數據處理模型以及測序片段讀長較短是目前的主要挑戰[3]。

3 中醫證候與轉錄組差異表達研究

證候是疾病發展過程中某一階段的病理概括[25]，證候的出現必然存在著與形成疾病證候病理變化相應的基因結構或功能的改變[11]。現代研究顯示轉錄組與許多疾病的發生發展有重要聯系[5]，其表達水平在不同病理和特定狀態下具有顯著差異。近些年，很多學者將轉錄組學引入證候研究，通過芯片或測序技術觀察和篩選不同證候間差異表達的轉錄組，再根據已有的基因數據庫注釋信息，對其進行生物信息學分析，歸納其參與的生物過程與信號通路，試圖發現證候的生物學基礎。目前主要在mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA層面做了相關研究，取得一定進展。

3.1 mRNA

mRNA是由DNA模板鏈轉錄，攜帶遺傳信息并能指導蛋白質合成的一類核糖核酸，其結構包括5′帽子、非編碼區、編碼區和3′PolyA尾，除了傳遞遺傳信息，編碼蛋白質（肽鏈）功能外[26]，還被發現是一種競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），參與基因表達的調控[27]。mRNA差異表達與各系統疾病均存在一定聯系[28-30]，用于臨床診斷、疾病分型、個性化治療等方面[30,31]。中醫證候的mRNA差異表達研究包括冠心病血瘀證[32]，HIV/AIDS氣陰兩虛和濕熱內蘊證[33]，慢性乙型肝炎肝郁脾虛證和脾胃濕熱證[34]等。

陳氏等[32]運用AFFX Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片和RT-PCR技術（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）調查冠心病血瘀證差異表達譜，結果共有107條基因存在差異表達，上調基因48條，下調基因59條，通過GO（Gene Ontology）和信號通路分析，發現其中有14條差異基因和4/15的信號通路與炎癥、免疫反應相關。張氏等[33]運用AFFX Human Genome U133 Plus 2.0 Chips芯片技術分析HIV/AIDS氣陰兩虛和濕熱內蘊證基因差異表達，結合基因功能分析，結果發現氣陰兩虛證共有113條基因差異表達（41條上調，72條下調），與細胞活動、通訊、蛋白質定位、細胞離子穩態和細胞運動調節等功能有關，濕熱內蘊證共有76條基因差異表達（14條上調，62條下調），與細胞應激反應，以及造血或淋巴器官發育等功能有關。范氏等[34]采用Aglient表達譜芯片篩選慢性乙型肝炎肝郁脾虛證和脾胃濕熱證患者的差異表達基因，并通過GO、Pathway、Genbank等數據庫對差異基因進行分析和動態網絡構建，結果找到共表達能力差異最顯著的9個基因（LOC340508、HIST2H2BE、MPL、FLJ22536、TUBA8、NT5M、EGFL7、PTPRF、TSPAN33），主要涉及免疫反應、細胞生長、DNA損傷、信號轉導、炎癥反應等生命過程。

3.2 MiRNA

MiRNA是一類長度為19-23個核苷酸（nucleotide，nt）的非編碼RNA，具有高度序列保守性、時序性和組織特異性等特點，以及調控基因表達，調節細胞早期發育，參與細胞分化、增殖和凋亡等生物學功能。醫學研究顯示，miRNA差異表達在腫瘤、心臟、神經系統等疾病呈現一定規律，目前被應用于疾病診斷，個性化治療和預后判斷中[35-37]。一些學者將其用于證候研究，分析了冠心病血瘀證[38]、高血壓血瘀證[39]、乙型肝炎肝膽濕熱證和肝腎陰虛證[40]、胰腺癌濕熱證[41]miRNA的差異表達。

王氏等[38]使用Agilent RNA 6000 Nano assay芯片和實時熒光定量PCR技術分析了冠心病不穩定型心絞痛血瘀證miRNA差異表達，結果發現miR-146b-5p，miR-199a-5p在血瘀證組表達顯著上調（P＜0.01），認為其可能成為血瘀證診斷的生物標志物。何氏等[39]使用Illumina HiSeq2000測序和qRT-PCR技術篩選了高血壓血瘀證相關miRNA，結果發現，miR-199a-5p和miR-1283在血瘀證組表達顯著下調（P＜0.05），因此認為其可能是高血壓病血瘀證形成的特異性相關miRNA。張氏等[40]使用Agilent Human miRNA microarray V3芯片和qRT-PCR技術，分析了慢性乙型肝炎肝膽濕熱證、肝腎陰虛證患者與健康人血清miRNA差異表達，結果顯示miR-583和miR-663分別在肝膽濕熱證和肝腎陰虛證患者血清中顯著上調（P＜0.001），溶解曲線結果提示指標具有較好靈敏度和特異度，可被用作證型區分的標志性分子。高氏等[41]采用qRT-PCR技術檢測胰腺癌濕熱證、脾虛證和無證型患者唾液中miR-21、miR-181a表達水平，結果顯示miR-21、miR-181a在濕熱組表達水平顯著降低。同時，高氏研究發現胰腺癌濕熱證患者預后較好，因此推斷miR-21、miR-181a可能作為胰腺癌預后判斷的指標之一。

3.3 LncRNA

長鏈非編碼RNAs通常指長度超過200 nt的非編碼RNA，其序列保守性較低，表達具有組織和時空特異性。lncRNA參與染色質重塑、基因轉錄、蛋白質運輸、細胞分化等多種生物過程，與冠狀動脈疾病、自身免疫性疾病、神經系統疾病、腫瘤等具有一定關聯性，被應用于疾病診斷、判斷預后、藥物靶標研究等生物醫學領域[42,43]。目前證候研究方面，主要是對冠心病血瘀證[44]，乳腺癌肝郁證[45]，肺結核[46]不同證候的lncRNA 差異表達譜的研究。

王氏等[44]采用Illumina HiSeq 2 500測序和qRTPCR技術篩選冠心病血瘀證相關差異表達lncRNA，結果發現冠心病血瘀證組39個lncRNA差異表達（Fold change＞2，p-value＜0.05），其中3個lncRNA上調，36個lncRNA下調。許氏等[45]采用Human IncRNA MicroarrayV3.0芯片和qRT-PCR技術篩選乳腺癌及其肝郁證相關IncRNAs，結果發現lncRNARP4-583P15.10和lncRNARPll-445H22.4與乳腺癌的發展和進展有關，進一步分組分析發現lncRNARPll-445H22.4在肝郁證組中明顯上調（P＜0.001）且溶解曲線分析提示敏感度和特異度較好，具有作為乳腺癌肝郁證患者早期診斷生物標志物的潛力。Jiang等[46]運用Human LncRNA Microarray V3.0分析肺結核患者不同證候的lncRNA表達譜，結果顯示肺陰虛證有566個lncRNA、肝火傷陰證有55個lncRNA、氣陰兩虛證60個lncRNA存在差異表達（Fold change＞2，p-value＜0.05）。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes）通路分析顯示差異表達基因與Hippo信號通路以及蛋白質消化、吸收途徑有關。

4 中醫證候與轉錄組調控網絡研究

證候表現是基因表達成蛋白質，并由蛋白質發揮生物學效應的結果，基因表達受多環節、多因素調控，解析基因表達的調控對于理解證候的發生、轉化具有重要的作用。基因表達的調控是一個復雜的相互作用網絡，轉錄組水平的調控是基因調控網絡的關鍵環節，也是目前研究的熱點。一些研究[47]已經闡明了miRNA-mRNA通過多重網絡調控基因表達的復雜機理。miRNA是關鍵的基因表達轉錄后調控因子。最新研究[27]表明，不同種類的RNA之間存在相互作用關系，且都可以憑借miRNA海綿的角色調控基因表達。這些RNA分子統稱為競爭性內源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNAs），它們通過與“共享”的miRNA競爭性結合互相傳遞信息或者互相調控。進一步探索ceRNAs之間調控關系將對基因調控網絡產生新的認識，也對人類的發展和疾病具有重要意義，對于闡明證候機制亦是同等重要。一些學者在證候的轉錄組調控網絡方面也進行了探索性研究并取得一定成果，主要涉及 miRNA-mRNA[38,48]，lncRNA-miRNA-mRNA[44]調控網絡，但總體來講，研究的數量和深度尚且不足。

王氏等[38]采用Agilent RNA 6000 Nano assay芯片技術篩查血瘀證患者miRNA和mRNA差異表達，發現401個mRNA和11個miRNA差異表達，然后運用miRWalk軟件根據miRNA預測相關靶基因并參照差異表達mRNA，結果發現miR-146b-5p，miR-199a-5p和23個目標mRNA形成了血瘀證的關鍵調控網絡（P＜0.01），經另一獨立隊列的qRT-PCR驗證得到相同結果，因此認為該網絡可用于血瘀證診斷。王氏等[49]又通過血塞通治療冠心病不穩定型心絞痛血瘀證觀察其對miR-146b-5p和miR-199a-5p及其富集的干預抗原呈遞和處理通路、p53信號通路和NK細胞介導的細胞毒性作用通路上的靶基因（KIR3DS1,HLA-DPB1,TP53SESN2,NCR1,PRF1）的影響，治療前后結果經qRT-PCR驗證，發現miR-146b-5p、miR-199a-5p可作為診斷標志物，且靶基因的變化趨勢提示miR-146b-5p、miR-199a-5p可以影響以上3條信號通路。另外，王氏等[44]采用Illumina HiSeq 2500測序和qRT-PCR技術進一步篩選冠心病血瘀證相關lncRNA-miRNA-mRNA調控網絡，結果顯示冠心病血瘀證相關差異基因包括39個lncRNA，229個miRNA和221個mRNA。通過聯合Pearson相關分析和starBase數據庫預測獲得的基因間調控關系，構建lncRNA，miRNA，mRNA之間的共調控網絡。符合共調控條件的共有9個lncRNA，31個mRNA和24個miRNA構成共調控網絡，包括76個基因間調控關系。此外，武氏等[48]采用AFFX Human Genome U133 Plus 2.0芯片技術分析HIV/AIDS濕熱內蘊證miRNA和mRNA表達情況，通過關聯分析發現了105對mRNA-miRNA，73條靶基因，靶基因主要參與對組織反應、調節增殖、凋亡等。

5 中醫證候轉錄組學的挑戰和前景

隨著分子生物學技術的發展，使得我們能夠從轉錄組學的層面認識證候，但轉錄組學蘊含龐大且復雜的信息給證候研究帶來新的挑戰：其一，高通量芯片和測序技術產生的海量數據與證候本身的復雜性使生物信息學處理與數據分析困難化；其二，研究多通過少量樣本尋找差異表達的RNA而未進行大樣本量的驗證，或驗證與篩選結果不一致使結論可信度降低；其三，即使篩選得到差異RNA，但缺乏“證候模型”下的細胞功能學驗證使發生機制尚不明確；其四，使用轉錄組調控網絡研究證候復雜系統，使復雜模型更加復雜化；其五，病證結合模式下的簡單分組對照研究，無法甄別差異RNA為疾病特異性還是證候特異性使結果模糊化。針對以上問題，亟需研究者深入思考并加以改進，比如保持轉錄組學技術與組學數據處理分析方法的更新，規范證候轉錄組研究的流程與方法，優化證候差異RNA篩選的分組設計方案等等。另外，環狀RNA[50]已作為新發現的ceRNA被廣泛用于西醫疾病研究，其高度保守性可能更利于臨床檢測，能否將其引入中醫證候研究也需進一步探索。

雖然中醫證候的轉錄組學研究還面臨諸多挑戰，但憑借高通量芯片、新一代測序及其它組學技術，中醫證候研究在轉錄組學層面以取得一定進展，通過分析轉錄組的差異表達和調控網絡，已發現部分證候相關RNA和轉錄組調控網絡的關鍵節點，它們將扮演證候生物標志物角色或用于闡明證候發生機制。借助此類研究，可為證候生物學基礎研究開辟新的道路，也能為進一步實現證候的早期診斷、早期治療以及促進中醫藥精準化醫療奠定夯實基礎。

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