膝骨關節炎再生修復治療新方法研究進展

張中原 余麗梅 ，3 王信

遵義醫學院附屬醫院1貴州省細胞工程重點實驗室，2貴州省組織損傷修復與再生醫學2011協同創新中心，3貴州省骨髓與羊膜間充質干細胞基礎與臨床研究科技創新人才團隊，4骨科（貴州遵義563003）

膝骨關節炎（keen osteoarthritis，KOA）是最常見的關節疾病，發病率隨著年齡的增長而顯著增加。據統計，全球60歲以上人群中發病率男性約占10%，女性約占18%，約80%的KOA患者行動受限，其中25%可導致殘疾［1］。已明確的KOA風險因素包括年齡、性別、創傷、肥胖、代謝功能障礙、環境和遺傳因素等，所致病理學改變為膝骨關節退行性變，特征改變是膝關節軟骨細胞功能減退和數量減少、軟骨基質減少。關節軟骨組織中唯一的軟骨細胞占關節軟骨體積的1%～5%，可分泌Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖和透明質酸等重要組分，并負責維持細胞外基質代謝平衡。研究已經證實TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、Notch、Indian hedgehog通路及一些炎癥因子均可刺激軟骨細胞肥大導致KOA的發生；且上述信號通路涉及破壞軟骨細胞合成和分解代謝平衡的多個共同靶基因，如Runx2、Mmp13和Adamts5等，并終致基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）和帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整鏈蛋白金屬蛋白酶（聚蛋白多/聚糖酶，a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS）上調，Ⅱ型膠原和蛋白聚糖合成減少而降解軟骨基質；炎癥免疫可促發或加劇軟骨的病理改變［2］。然而，由于關節軟骨自身沒有營養血管、淋巴管及神經存在，導致其自身修復能力也十分有限。

目前針對輕中度KOA患者的臨床癥狀，主要采用非手術治療，給予抗炎、鎮痛藥或補充硫酸軟骨素，局部注射透明質酸鈉、理療或中醫藥結合治療，這些措施可暫時緩解KOA的臨床癥狀或一定程度地阻滯病情進展，但很難完全修復受損的膝關節軟骨；中重度患者，則只能依靠馬賽克整形、軟骨下骨鉆孔、軟骨清理成形等手術干預，50歲以下的年輕患者雖有較好療效，但個體差異較大，膝關節修復面積有限，難以解決軟骨進行性損傷的根本問題，最終，只能選擇全關節置換手術，因此，一直以來KOA中損傷關節的完美修復一直是人們努力追求的理想方案。隨著人們對KOA發病機制、組織工程生物材料和種子細胞生物學特性和功能認識的深入，生長因子、血液成分提取物、干細胞或軟骨細胞移植、干細胞來源外泌體及基因治療等新方法越來越多地顯示了良好的KOA治療應用前景。

1 生長因子（growth factor，GF）

對KOA治療而言，所用GF主要為維持軟骨和骨骼穩態及其再生修復中產生重要作用的細胞因子，具有刺激軟骨細胞再生的作用，可促進軟骨細胞合成代謝與軟骨基質分泌，轉化生長因子超家族，特別是骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein）BMP-2和BMP-7、成纖維細胞生長因子和成纖維細胞生長因子-18及胰島素樣生長因子-1、軟骨素等在軟骨和骨損傷修復中效果尤為顯著［3-4］。它們不但在軟骨和骨骼組織中表達，還通過調節炎癥、免疫、成纖維化細胞、軟骨細胞和成骨細胞功能，及多種信號通路相互串擾，調節膝關節局部組織細胞的多個分解和合成代謝過程，而發揮治療作用［5］，其治療效果也取決于這些GF的內源性水平、使用劑量、關節腔內環境、配合應用的生物支架材料及關節局部的生物力學完整性等［3］。雖然上述GF的再生潛力已在不同程度的創傷或退行性變所致KOA動物的治療學研究中被確證，但尚缺乏規范、完整的人體臨床試驗，單一GF或多種GF聯合應用的療效差異也不盡相同。

2 血液成分提取物（blood composition extrction）

最近的研究表明，血液成分提取物不但具有減輕關節局部炎癥反應的作用，也可較好地恢復膝關節再生修復的局部微環境，生物安全較好，制取方便，可通過微創局部給予。自體血液成分提取物所提供的多種生物活性分子可以實現膝關節軟骨和骨組織局部自我平衡的恢復及退化組織的再生。20世紀90年代中期首個血液成分提取物——自體血清（autologous serum，ALS）應用于臨床，ALS含有豐富的內源性IL-1受體拮抗劑，可很好地阻斷IL-1β的作用，而IL-1β是KOA發病機制中最重要的炎癥免疫反應介質之一。ALS膝關節局部注射治療KOA的隨機、雙盲、對照試驗表明，ALS的療效明顯優于透明質酸局部注射［6］，在Kellgren-Lawrence評分2～3級和晚期KOA患者的治療中，ALS還可能通過降低炎癥因子水平而產生抗炎效應，但ALS對骨代謝的影響尚不清楚［7］。近年使用的富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）微創注射治療KOA的顯著療效也備受關注，多種生長因子儲存在血小板α顆粒中，可明顯改善關節軟骨的合成代謝，是PRP發揮治療作用的重要基礎［8］。但這種療法效果持續的時間有限，約6～12個月，且不能支持受損關節軟骨的再生，PRP結合膝關節軟骨再生種子細胞的策略，可能是解決這一難題的新思路，PRP生物學活性和功能的全面了解也對進一步合理開發KOA治療應用具有重要意義。

3 間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）與軟骨細胞

近20多年來，MSCs在KOA治療中顯示了良好的促進軟骨組織再生修復、上調軟骨細胞分泌功能的突出作用優勢，MSCs通過直接的細胞間相互作用或分泌生物活性分子的間接作用，顯著改善局部微環境，發揮營養、免疫調節和抗炎等多種生物學活性，已逐漸成為治療KOA最具吸引力的新方法，局部應用MSCs后，其強大的分泌功能及分泌外泌體中所包含的miRNA、多種GF、抗炎因子等，也是MSCs促進軟骨組織再生，改善關節組織細胞外基質條件，恢復軟骨下骨微循環的重要始動因素，MSCs輸注經體循環還可能補充了機體不足的MSCs池［9］。

體外擴增的骨髓來源MSCs或富集的非擴增骨髓來源干細胞均對KOA產生相似的滿意治療效果，主要表現為運動功能和關節、滑膜的OARSI評分恢復，以及軟骨基質中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖合成增多等組織病理學的改善，可能涉及MSCs抑制TGF-β/Smad，Wnt/β-catenin等信號通路，導致下游靶基因MMPs和ADAMTS表達下調，從而軟骨基質中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖合成增多，骨髓MSCs對IL-1、IL-6和TNF-α等炎性介質的明顯抑制作用也在減輕關節軟骨損傷方面起了重要作用［10-11］。

皮下脂肪組織來源的脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）由于采簡單、侵入性較低，對KOA的治療也受到關注。體外擴增的ADSCs或僅通過抽吸、離心等富集的基質血管部分（stromal vascular fraction，SVF）即含有包括ADSCs在內的不同細胞類型，在關節鏡手術下注射至關節腔內，均可通過軟骨再生而治療局灶性大面積軟骨病變［12］；也有研究報道，骨髓MSCs的體外軟骨形成潛能明顯高于ADSCs［13］；而膝關節外科手術中，易獲取的髕下膝關節Hoffa脂肪墊也被認為是MSCs的另一理想來源，具有更高的軟骨分化潛能［14］。粒細胞集落刺激因子刺激后的外周血應用于KOA治療也具有很好的可行性，外周血中含有相當數量的包括MSCs、HSCs在內的干祖細胞［15］。新近的一項臨床試驗中，在關節鏡下，軟骨下鉆孔和關節內注射自體外周血MSC結合透明質酸治療全層軟骨損傷，產生了十分明顯的軟骨再生、修復［16］。雖然采集技術還比較困難，但是擴增的滑膜組織來源的MSC也被認為是膝關節軟骨修復的另一選擇，關節鏡清理術后，可將這種MSCs直接注射到損傷部位，也顯示了可觀的治療效果［17］。肌源性干細胞也是軟骨修復的潛在種子細胞，裸鼠的KOA模型中，運用逆轉錄病毒轉導編碼BMP-4和sFlt1（血管內皮生長因子-VEGF拮抗劑）基因的肌源性干細胞結合PRP治療，產生了令人鼓舞的顯著療效［18］。臍帶MSCs治療KOA已成為首個國外上市的臍帶MSCs制劑，在韓國進行的臍帶MSCs干細胞和透明質酸鈉治療關節軟骨缺損的Ⅱ期臨床試驗顯示，關節的軟骨損傷得到了良好的修復，且KOA治療的有效性和安全性已在72個月的隨訪研究中進一步得到了證實［19］。

體外培養的自體軟骨細胞和自體軟骨片在臨床治療KOA中，已取得滿意的療效，但因創傷性取材及可獲取軟骨細胞數量極其有限，使其臨床應用受到較大限制。荷蘭正在進行的Ⅱ期臨床試驗中，采用纖維蛋白膠結合同種異體骨髓MSCs和帶周圍基質的自體軟骨細胞，用于治療局灶關節軟骨缺損也取得了明顯的治療效果，且療效由于自體軟骨細胞移植［20］；與植入自體軟骨細胞相比，基質誘導的自體MSCs植入顯示出更早的臨床癥狀改善［21］。

4 MSCs來源的外泌體（stem cell-derived exosomes）

MSCs分泌的外泌體（exosomes）也具有治療KOA的作用。外泌體是細胞間的一種高效通訊載體，主要傳遞生物活性核酸（mRNA和microRNA）、蛋白質及脂質［22］。骨髓來源MSCs所分泌的外泌體治療膠原酶誘導的KOA效果可觀［23］，而誘導多能干細胞來源的外泌體治療KOA的效果優于滑膜MSCs來源的外泌體［24］。外泌體的作用機制主要涉及相關microRNA的調節作用，microRNA與其靶基因轉錄的mRNA特異性結合，沉默表達的靶基因，或形成多個信號的相互作用網絡。目前的研究主要集中于microRNA在KOA發病中的作用機制及對骨和軟骨形成的調控［25］，而關于干細胞來源外泌體分泌miRNA參與KOA修復治療的機制尚不清楚。沉默microRNA-34a可有效降低骨性關節炎中軟骨細胞凋亡［26］。本課題組最近的研究已顯示羊膜和臍帶MSCs及二者來源的外泌體均對大鼠KOA具有顯著的治療效果，且羊膜MSCs可明顯改變KOA鼠關節液中的眾多miRNA表達水平，尤其是一些參與炎癥反應調節的關鍵miRNA及其靶向沉默的多個炎癥因子及基質金屬蛋白酶等［27］。因此深入探討MSCs來源外泌體治療KOA的作用機制，可能對開發MSCs來源外泌體的臨床應用具有重要意義。

5 基因治療

通過基因工程技術，轉導一些編碼軟骨細胞生長的重要細胞因子，而促進軟骨再生，或轉導抗炎因子，減輕炎癥反應，產生持續的KOA治療作用，也是一種頗有應用前景的KOA基因治療方案。應用同種異體軟骨細胞基因工程產生TGF-β1，將這種基因修飾的細胞植入關節內治療嚴重的晚期KOA的Ⅰ和Ⅱ試驗，已表明關節功能和臨床癥狀得到顯著改善［28-29］。一項隨機雙盲、多中心、安慰劑對照Ⅲ期臨床試驗隨訪1年后，也發現單次給予逆轉錄病毒轉導TGF-β1軟骨細胞后，KOA癥狀得到持久、顯著的改善［30］；其他的相似研究也不斷證明，基因治療KOA具有非常良好的應用前景。

6 展望

盡管生物治療方法在緩解KOA癥狀和軟骨修復再生展現出理想的療效，但由于KOA的病因及發病機制尚不明朗，在軟骨修復再生質量和長期穩定療效以及明確的治療機制方面還需進行大量針對性的研究。而聯合應用多種生物治療方法，可能會更為有效的減輕KOA損傷和更好地再生修復。在未來這應該是主要的研究方向，在不久的將來生物治療方式可能會是臨床KOA的主要治療方式。

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