FAM19A4基因啟動子甲基化檢測在宮頸癌組織中的臨床意義

布俏雯 張亮 王三鋒 馬健 胡桂英 伍恒英 羅喜平

廣州醫科大學附屬廣東省婦幼保健院婦科（廣州 510010）

宮頸癌是世界范圍內繼乳腺癌及直腸癌后的第三大女性惡性腫瘤，每年約有500 000的新發病例，造成250 000例死亡［1］。因此能盡早發現宮頸病變，對宮頸癌的預防和治療有重要意義。目前主要通過液基薄層細胞學檢測（thinprep cytologic test，TCT）和HPV聯合檢測手段篩查宮頸癌。但TCT敏感性較低，造成較高的假陰性率，聯合HPV檢測雖然提高了發現CIN2+以上病變的靈敏度，但是特異度仍較低。最新研究［2］發現聯合DNA甲基化檢測技術既能保持診斷宮頸病變的靈敏度，又能提高特異性。因此，將靶基因甲基化檢測技術應用到宮頸癌的早期篩查中能提高宮頸病變的檢出率。研究［3］表明在宮頸癌及癌前病變中，宿主基因DNA甲基化導致抑癌基因沉默，從而導致癌變。因此，尋找在宮頸癌中高甲基化而在正常宮頸中非甲基化的特異性分子標志物，補充目前宮頸癌早期篩查方法的不足，具有重要意義。國外已有研究［4-5］發現在宮頸細胞中，FAM19A4基因甲基化能作為新型的腫瘤標記物，高效鑒別宮頸癌與正常宮頸組織。但國內目前尚無FAM19A4基因啟動子甲基化在宮頸癌及其癌前病變診斷中應用價值的相關文獻報道。本文采用雙探針熒光定量PCR技術檢測正常宮頸組織、宮頸HSIL及宮頸癌組織中FAM19A4基因的甲基化情況，并比較該甲基化情況在宮頸癌的不同臨床特征中的差異，分析該基因的甲基化在宮頸癌發生、發展中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 資料來源 隨機收集2017年1月至2017年8月間就診于我院，分別因宮頸癌、宮頸HSIL、子宮脫垂行子宮切除術的甲醛固定-石蠟包埋組織（formalin-fixed and paraffin-embedded，FFPE）標本，經我院2名以上病理醫師分別診斷為宮頸癌、宮頸HSIL（CIN3）及正常宮頸共76例（分別為31例、22例和23例）。不同宮頸病變組別平均年齡分別為：（47.42 ± 9.34），（42.45 ± 9.06），（48.30 ± 12.32）歲，年齡間差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA的提取 利用TIANamp FFPE DNA提取試劑盒（北京天根公司生產）提取石蠟包埋標本的DNA，按試劑盒說明書提供的方法操作。以上提取的DNA使用Quawell Q5000紫外分光光度計進行濃度測量，保存于-20℃冰箱備用。

1.2.2 重亞硫酸鹽修飾 將提取的DNA進行重亞硫酸氫鹽處理（模板DNA濃度為500 ng），利用EZ DNA Methylation-DirectTM試劑盒（美國Zymo Research公司產品），按試劑盒說明書提供的方法操作。重亞硫酸鹽修飾后的DNA立即用于熒光定量PCR檢測，剩余樣本儲存在-20℃冰箱。

1.2.3 雙探針熒光定量PCR 美國ABI 7500型實時熒光定量PCR系統（Life Tech）用于進行實時熒光定量PCR技術檢測宮頸細胞刷液中FAM19A4基因的甲基化情況。以宮頸癌FFPE-DNA、正常外周血DNA、雙蒸水分別作為陽性對照、陰性對照和空白對照模板。反應體系共20 μL，主要包括：2×Premix Type試劑10 μL；50 × Rox Reference Dye II試劑0.2 μL；FAM19A4基因上、下游引物各0.5μl；ACTB內參基因上、下游引物各0.5 μL；FAM19A4基因及ACTB內參基因探針各0.8 μL；純水5.2 μL；樣本量1 μL（FAM19A4基因及ACTB內參基因的引物及探針序列如表1所示）。PCR反應條件：95℃預變性3 min；然后95℃變性15 s，56℃退火20 s及65℃延伸40 s，共進行40個循環。每個樣本均進行了3次重復試驗。擴增結果判定：熒光定量PCR技術擴增后，經ABI 7500收集熒光信號，獲得內參基因和目標基因的循環閾值（CT值）及擴增曲線（宮頸癌、正常宮頸及空白對照的擴增曲線如圖1所示），計算兩基因CT值間的閾值差（ΔCT），綜合判定不同樣本的甲基化程度。以ACTB為內參，計算ΔCT=CT目標基因-CT內參，并同時結合擴增曲線判斷甲基化情況，且ΔCT值越小，擴增曲線目標基因越早擴增，表示基因甲基化水平越高。

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示。計數資料采用Pearson卡方檢驗或連續校正或Fisher精確概率法，α=0.05；其中組內兩兩比較采用Bonferroni校正。線性趨勢采用Cochran-Armitage趨勢檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 FAM19A4及ACTB基因的引物及探針序列Tab.1 The sequences of primers and probes for the FAM19A4 and ACTB genes

2 結果

2.1 比較不同嚴重程度宮頸病變FFPE樣本的FAM19A4基因啟動子甲基化檢出率的差異 采用雙探針熒光定量PCR分別檢測宮頸癌、宮頸HSIL和正常宮頸組織FFPE中FAM19A4基因啟動子發生甲基化的情況，發現在31例宮頸癌FFPE中FAM19A4基因甲基化檢出率最高（96.8%），22例宮頸HSIL組織有16例發生甲基化（72.7%），21例正常宮頸組織僅2例發生甲基化（8.7%），3組間甲基化檢出率存在統計學差異（P＜0.05）。接著進行組內兩兩比較，經分析發現宮頸癌組的FAM19A4基因甲基化檢出率高于宮頸HSIL組（96.8%vs.72.7%，P＜0.05）；宮頸癌組的FAM19A4基因甲基化檢出率高于正常宮頸組（96.8%vs.8.7%，P＜0.05）；宮頸HSIL組的FAM19A4基因甲基化檢出率高于正常宮頸組（72.7%vs.8.7%，P＜0.05）。見表2。

圖1 宮頸癌、正常外周血DNA及空白對照樣本的的擴增曲線Fig.1 Amplification curves of cervical cancer,normal peripheral blood DNA and blank control samples

表2 宮頸癌與非癌病變FFPE組織中FAM19A4基因啟動子甲基化檢出率的比較Tab.2 Comparison of detection rates of FAM19A4 gene promotor methylation in FFPE tissues of cervical cancer and non-cancerous lesions

采用Cochran-Armitage趨勢檢驗判斷宮頸病變程度與FAM19A4甲基化之間是否存在線性趨勢，發現二者間存在線性趨勢（χ2=42.572，P＜0.05），即從正常宮頸到癌前病變再進展為宮頸癌，隨著宮頸病變嚴重程度增加，FAM19A4基因甲基化的檢出率逐漸升高。

2.2 宮頸癌不同臨床病理特征與FAM19A4基因啟動子甲基化檢出率間的關系 31例宮頸癌患者的平均年齡為47.42歲，宮頸癌的年齡分組、組織學分型、臨床分期（FIGO，2009年）、腫瘤大小及淋巴結轉移狀態的分組情況如下表所示，發現宮頸癌不同年齡段、病理類型、臨床分期、腫瘤大小及淋巴結轉移狀態的FAM19A4基因啟動子的甲基化檢出率間差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 宮頸癌臨床病理特征與FAM19A4基因啟動子甲基化檢出率間的關系Tab.3 Relationship between clinicopathological characteristics of cervical cancer and the detection rates of FAM19A4 gene promoter methylation 例

3 討論

3.1 DNA甲基化與宮頸癌的關系及FAM19A4基因的功能介紹 宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，其發病率及病死率均較高，但發病機制仍不明確。高危型HPV（high risk human papillomavirus，hr-HPV）感染是宮頸癌及其癌前病變的主要致病原因，hr-HPV還能誘導宿主細胞發生遺傳及表觀遺傳的改變導致癌變［6］。表觀遺傳改變是指無需改變基因核苷酸序列但能改變基表型的過程。研究表明，表觀遺傳水平發生變異的頻率是基因突變頻率的10倍［7］。因此，檢測表觀遺傳學變異診斷腫瘤具有更高的穩定性、靈敏度和特異度。其中DNA甲基化是最常見的表觀遺傳學之一，由DNA甲基轉移酶（DNMT）催化并維持，使DNA啟動子CpG島中胞嘧啶殘基的C5轉化為5-甲基胞嘧啶，進一步導致基因的沉默失活［3］。研究［8］表明，DNA啟動子甲基化與宮頸癌的發生發展密切相關，可作為宮頸癌早期診斷的分子標志。具有序列相似性的19家族（趨化因子（C-Cmotif）-樣）成員 A4（family with sequence similarity 19 member A4，FAM19A4）是TAFA基因家族成員，其編碼的細胞因子FAM19A4是一種分泌蛋白，是甲酰肽受體-1（FPR1）的配體，能趨化巨噬細胞，促進吞噬酵母聚糖并增加ROS釋放。研究發現FAM19A4在正常組織中呈低表達，而在單核細胞及巨噬細胞中表達上調，能促進巨噬細胞的吞噬及遷移作用，調控炎癥感染及應激反應［9-10］。

3.2 FAM19A4基因甲基化檢測在宮頸癌診斷中的臨床意義 STEENBERGEN等［4］首先使用人染色體核型分析技術在宮頸組織水平驗證了FAM19A4基因啟動子甲基化有望作為宮頸癌的新型靶向分子標記物。研究發現其在宮頸癌及正常宮頸組織中的檢出率存在明顯表達差異（84%vs.5%），其中鱗癌與腺癌分別占91%（39/43）和73%（19/26）。本研究也發現了，與正常宮頸組織相比，FAM19A4基因甲基化檢出率在宮頸癌組織中異常增高（8.7%vs.96.8%），與文獻報道相似［4］。本研究在宮頸癌前病變中（HSIL），同樣檢測到較高水平的FAM19A4基因甲基化（72.7%），遠高于STEENBERGEN等報道的10%（4/42），提示該基因甲基化同樣有望成為預測宮頸癌前病變的分子標記物。此外，已有研究在宮頸細胞刷液或灌洗液中，發現FAM19A4基因甲基化也能有效檢測出宮頸癌及其癌前病變［5，11-13］。STROOPER 等［5］發現HPV感染持續5年以上的CIN2/3及宮頸癌病變中，均檢測出FAM19A4基因甲基化；而HPV感染持續不足5年的CIN2/3病變中，僅有42.1%檢測出FAM19A4基因甲基化。該研究表明FAM19A4甲基化水平隨著宮頸病變進展而增高，該基因的甲基化檢測能預測不同程度的宮頸病變進展為癌變的風險。本研究通過趨勢檢驗也進一步說明了隨著宮頸病變嚴重程度增加，FAM19A4甲基化檢出率越高，FAM19A4基因甲基化可能促進宮頸癌的發生發展，是宮頸細胞癌變的特異性生物標志物。本研究也首次結合宮頸癌的臨床病理特征分析，發現FAM19A4基因甲基化均與年齡、病理類型、臨床分期、腫瘤大小及淋巴結轉移狀態無關。由此推測，FAM19A4基因甲基化是宮頸癌發生的早期事件，但可能與宮頸癌的生長活力及侵襲轉移特征無關。

3.3 FAM19A4基因甲基化檢測與傳統宮頸癌篩查技術（HPV分型及TCT）的比較 與細胞學及HPV16/18分流相比，FAM19A4基因啟動子甲基化對檢測CIN3及以上病變（≥CIN3）的靈敏度不明顯劣于前兩者，但特異度均顯著增高（分別為49.8%和57.4%vs.71.1%），有望成為hr-HPV陽性婦女的分流方案［13］。為了避免細胞學的額外取材，有研究將HPV16/18分型與FAM19A4基因甲基化結合用于檢測≥CIN3或≥CIN2病變，發現兩者結合雖然較單純甲基化檢測降低了特異度，但大大增加了靈敏度（分別為92%和76.5%）［11-12］。因此將HPV分型與靶基因甲基化檢測同時結合運用于宮頸癌（前）的篩查，能顯著減少其漏診風險。

綜上所述，本研究從宿主基因水平的變化表明了宮頸組織可能受表觀遺傳影響發生癌變，但僅在組織水平驗證了FAM19A4基因甲基化可能是宮頸癌病變的分子標志物，并未從取材更為方便的宮頸細胞刷液水平做進一步研究，更未進行隨訪研究，論證發生FAM19A4基因甲基化的癌前病變是否具有更高進展為惡性腫瘤的風險，這是本研究不足之處。未來研究中擬從宮頸細胞刷液甚至自取宮頸細胞灌洗液出發，進行前瞻性的隊列研究，探索FAM19A4基因甲基化與宮頸癌（前）病變的關系，希望將該基因甲基化檢測應用在宮頸癌（前）病變的早期診斷中。

參考文獻

［1］TORRE L A，BRAY F，SIEGEL R L，et al.Global cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

［2］SAHASRABUDDHE V V，LUHN P，WENTZENSEN N.Human papillomavirus and cervical cancer：biomarkers for improved prevention efforts［J］.Future Microbiol，2011，6（9）：1083-1098.

［3］JONES P A，BAYLIN S B.The fundamental role of epigenetic events in cancer［J］.Nat Rev Genet，2002，3（6）：415-428.

［4］STEENBERGEN R D，ONGENAERT M，SNELLENBERG S，et al.Methylation-specific digital karyotyping of HPV16E6E7-expressing human keratinocytes identifies novel methylation events in cervical carcinogenesis［J］.J Pathol，2013，231（1）：53-62.

［5］De STROOPER L M，MEIJER C J，BERKHOF J，et al.Methylation analysis of the FAM19A4 gene in cervical scrapes is highly efficient in detecting cervical carcinomas and advanced CIN2/3 lesions［J］.Cancer Prev Res（Phila），2014，7（12）：1251-1257.

［6］STEENBERGEN R D，SNIJDERS P J，HEIDEMAN D A，et al.Clinical implications of（epi）genetic changes in HPV-induced cervical precancerous lesions［J］.Nat Rev Cancer，2014，14（6）：395-405.

［7］THOMAS R K，BAKER A C，DEBIASI R M，et al.Highthroughput oncogene mutation profiling in human cancer［J］.Nat Genet，2007，39（3）：347-351.

［8］WENTZENSEN N，SHERMAN M E，SCHIFFMAN M，et al.Utility of methylation markers in cervical cancer early detection：appraisal of the state-of-the-science［J］.Gynecol Oncol，2009，112（2）：293-299.

［9］WANG W，LI T，WANG X，et al.FAM19A4 is a novel cytokine ligand of formyl peptide receptor 1（FPR1）and is able to promote the migration and phagocytosis of macrophages［J］.Cell Mol Immunol，2015，12（5）：615-624.

［10］LIU H，WANG X，SHI S，et al.Efficient production of FAM19A4，a novel potential cytokine，in a stable optimized CHO-S cell system［J］.Protein Expr Purif，2015，113：1-7.

［11］LUTTMER R，De STROOPER L M，DIJKSTRA M G，et al.FAM19A4 methylation analysis in self-samples compared with cervical scrapes for detecting cervical（pre）cancer in HPV-positive women［J］.Br J Cancer，2016，115（5）：579-587.

［12］De STROOPER L，VERHOEF V，BERKHOF J，et al.Validation of the FAM19A4/mir124-2 DNA methylation test for both lavage-and brush-based self-samples to detect cervical（pre）cancer in HPV-positive women［J］.Gynecol Oncol，2016，141（2）：341-347.

［13］LUTTMER R，De STROOPER L M，BERKHOF J，et al.Comparing the performance of FAM19A4 methylation analysis，cytology and HPV16/18 genotyping for the detection of cervical（pre）cancer in high-risk HPV-positive women of a gynecologic outpatient population（COMETH study）［J］.Int J Cancer，2016，138（4）：992-1002.