沙棘黃酮檢測方法概述

陳 春

(1.山西省林業科學研究院，山西 太原 030012;2.國家林業局沙棘工程技術研究中心，山西 太原 030012)

沙棘為藥食兩用植物，一直以來都作為傳統藥物被用來治療疾病，收錄于《中國藥典》。沙棘含有多種化合物，包括黃酮類化合物、類胡蘿卜素、甾醇類、生育酚、脂類，還含有抗壞血酸、單寧等物質[1]，具有抗菌消炎、擴張冠狀動脈、治療高血壓和腦溢血、抗癌等作用。沙棘黃酮主要包括異鼠李素、槲皮素、山奈酚、楊梅素等黃酮苷元及其苷類物質[2]。現在，可從沙棘中分離出的黃酮類化合物達32種[3]，且含量較高。例如，中國沙棘果實每100 g含有黃酮885.4 mg；西藏沙棘果實的黃酮含量更高，每100 g含1 104.7 mg 黃酮。

沙棘黃酮含量作為評價沙棘品質的常見指標，其主要檢測方法包括：光譜分析法、色譜分析法、電化學分析法、化學發光法等。筆者對各檢測方法進行了綜述，旨在為今后沙棘黃酮的研究、開發及應用提供一定的參考。

1 光譜分析方法

1.1 紫外分光光度法

黃酮類化合物在紫外光圖譜上主要有2個吸收帶，環肉桂酰類物質在300 nm～550 nm產生的吸收帶以及環苯酰類物質在240 nm～280 nm產生的吸收帶[4]。通過對光譜區的吸光度值進行測定，根據溶液濃度和吸光度標準曲線進行計算可得到目標檢測物質的濃度值。利用紫外分光光度法檢測沙棘黃酮含量具有簡便、準確度高、重現性好且檢測技術易于掌握、儀器設備簡單的優點[5]。紫外分光光度法檢測沙棘黃酮，具體又分為以下3種方法：亞硝酸鈉-氯化鋁-氫氧化鈉法、硝酸鋁-醋酸鉀法和三氯化鋁法。

1.1.1 亞硝酸鈉-氯化鋁-氫氧化鈉法

亞硝酸鈉-氯化鋁-氫氧化鈉法是沙棘黃酮檢測較為常見的方法之一，在氫氧化鈉提供的堿性環境條件下，金屬鋁離子與沙棘黃酮類物質反應生成紅色絡合物[6,7]。在對沙棘不同部位的黃酮進行檢測時，雖然對照品都是蘆丁，但最大吸收波長和使用的乙醇溶劑濃度不同。沙棘葉、果部位吸收波長為510 nm，而果渣為500 nm；沙棘葉使用乙醇溶劑的濃度為70%，沙棘果為35%乙醇，沙棘果渣為30%乙醇[8]。因此，在用亞硝酸鈉-氯化鋁-氫氧化鈉法檢測沙棘黃酮時，要嚴格控制溶劑的濃度、試劑的添加時間、顯色時間等，盡可能減少操作誤差。

1.1.2 硝酸鋁-醋酸鉀法

硝酸鋁-醋酸鉀法檢測沙棘黃酮含量，是依據鋁離子同黃酮類化合物中的3位羥基、4位羰基或5位羥基、4位羰基或鄰二酚羥基發生反應，生成絡合物，使得吸收峰紅移，從而測定出黃酮的含量[9]。

1.1.3 三氯化鋁法

三氯化鋁法的原理是在酸性條件下，沙棘黃酮醇母核中的5位羥基、4位羰基與金屬鋁離子絡合產生物對400 nm波長有最大吸收[10]。利用三氯化鋁法對沙棘黃酮進行測定時，應根據黃酮含量的不同選擇不同的對照標準品，包括蘆丁、槲皮素和異鼠李素，并且使用不同濃度的乙醇溶解[11]。

1.2 熒光分光光度法

熒光分光光度法(flourescence)的原理是：紫外線照射在由黃酮類物質與特定的金屬離子絡合產生的絡合物上時會產生熒光，在一定的條件下，熒光的強度與絡合物的濃度呈正相關，由此可以得到待測物質中黃酮類物質的總含量。雖然熒光光度法靈敏度高，準確性、重現性較好，同時具有操作簡便的優點，在科研和生產實踐中應用于植物黃酮的檢測報道較多[12,13]，但是應用于沙棘黃酮檢測的報道較少[14]，有待進一步深入研究。

2 色譜分析方法

2.1 高效液相色譜法

黃酮類物質均具有不易揮發、熱不穩定、分子離子峰穩定，游離的苷元難溶或不溶于水、易溶于有機溶劑，黃酮苷易溶于水、甲醇、乙醇等強極性溶劑[15]的特點。因為黃酮苷具有極性強、難氣化、不穩定的特點，所以高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)是重要的沙棘黃酮檢測方法。高效液相色譜法采用高壓液泵、高效固定相、液體流動相、高壓輸出進行檢測分析，具有分離效能高、分析速度快、靈敏度高的優點，同時還可以得到沙棘待測樣品中各個黃酮組分的具體含量數值[16]。但也存在檢測設備昂貴、消耗流動相較多、檢測成本高的缺點。當前使用較多的是反相高效液相色譜[17，18]，分離柱為C8柱和C18柱，以甲醛-水、乙腈-水為流動相。流動相的選擇會直接影響出峰時間、分離度，可以通過調節 pH 值來改善色譜圖的峰型。

2.2 薄層色譜法

薄層色譜法(TLCS)是將色譜技術和光密度計、電子計算機相結合的一種儀器分析方法。一定波長的光照射在薄層上，對薄層色譜中有紫外或可見光吸收的斑點，或經照射能激發產生熒光的斑點進行掃描，將掃描到的圖譜及積分值換算為藥品的質量。薄層色譜法具有多通道效應，可以同時平行分離分析多個待測的沙棘樣品；流動相色譜使用量也較高效液相色譜少，且更換方便；對樣品的預處理要求也不高[19-21]。薄層色譜法是中藥制劑檢驗中較為常用的分析方法，在《中國藥典》中有33個中成藥品種采用該法進行含量測定。在沙棘黃酮檢測中也有使用，方法簡便、特異性強、重現性好,可作為沙棘黃酮檢測的優選方法之一。

2.3 超臨界流體色譜法

超臨界流體色譜法(Super Fluid Chromatography，SFC)是20世紀80年代發展起來的一種新型色譜技術。它具有氣相和液相色譜所沒有的優點,能分離、分析氣相和液相色譜不能解決的一些對象,應用廣泛,發展迅速。在使用超臨界流體色譜法檢測黃酮時，利用超臨界流體或添加了改性劑的超臨界流體做流動相，使黃酮單體分離后測定。目前該方法主要用于銀杏葉黃酮的檢測[22,23]，對沙棘總黃酮含量檢測應用的相對較少[24]。

3 毛細管電泳電化學法

毛細管電泳(Capillary electrophoresis, CE)又稱高效毛細管電泳(Highperfor-mance capillary electrophoresis, HPCE),是一種應用非常廣泛的分離分析技術，現已被廣泛應用于生物、醫藥等領域的樣品分離檢測[25]。毛細管電泳具有高靈敏度、高分辨率、高速度，分離檢測用時少、樣品和流動相用量少、成本低的優點[26]。毛細管電泳電化學法是近年來發展迅速的分析檢測方法之一，也被應用在沙棘黃酮的檢測分析中[27]，但有待進一步發展。

4 流動注射化學發光法

流動注射分析(Flow Injection Analysis, FIA)是在非平衡熱力學條件下,在液流中重現地處理試樣或試劑區帶的定量流動分析技術。化學發光(Chemiluminescence, CL)是根據化學發光反應在某一時刻的發光強度或發光總量來確定反應中各組分的含量。將流動注射分析與化學發光結合形成的流動注射化學發光法(CL-FIA),是痕量分析法,具有分析速度快、線性范圍寬、精度和靈敏度較高、成本低和易于實現自動化等優點[28],主要應用于藥物、食品、環境檢測以及元素分析等領域[29]。早在20世紀90年代初，已被應用于沙棘的檢測了[30]，但沒有得到推廣。

5 結論

對以上4類方法進行比較，可以看出，各種方法在實際使用過程中各有利弊。紫外分光光度法是廣泛使用的方法，其優點是簡便、重復性好、易于學習掌握，使用的檢測儀器較為便宜，但也存在易受雜質干擾、穩定性差的缺點。光譜分析法中的高效液相色譜法不僅具有抗干擾、重現性穩定、分離效能高、分析速度快的優點，而且可以精確的檢測沙棘總黃酮中各個具體成分的含量，是目前沙棘總黃酮檢測的主流趨勢。其它檢測方法在沙棘總黃酮檢測中應用較少，一方面是受使用儀器設備所限，不利于推廣普及；另一方面是應用于沙棘總黃酮檢測時，方法還不夠成熟穩定，有待進一步探索研究。

隨著人們對沙棘黃酮作用的深刻認識，黃酮提取技術的不斷提高，以及儀器分析技術的日益進步，沙棘黃酮的檢驗檢測技術將來一定會更方便快捷、準確可靠。