植物內生菌研究進展

方珍娟 張曉霞 馬立安

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025) (中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100089) (長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

植物內生菌是指其生活史的一定階段或全部階段定殖于植物器官、組織內部以及細胞間隙的微生物，被感染的植物(至少是暫時)不表現出明顯的癥狀。根據對宿主植物造成的影響，植物內生菌可分為：內共生微生物和病原微生物；根據種類將植物內生菌分為真菌、細菌、放線菌，可以通過組織學方法從表面徹底消毒后的植物組織中分離出微生物或通過從表面消毒后的植物組織中擴增到微生物核DNA證實其存在[1～7]。植物體內普遍存在著內生菌，由于其生活在沒有外在感染癥狀的健康植物組織內部，因此植物內生菌的存在和作用長期以來未被發現。直到20世紀30年代，由于牲畜食用了感染內生真菌的牧草，給畜牧業造成重大損失，才開始對植物內生菌有了初步認識。內生菌一詞“endophyte”最早是由德國科學家DeBarry于1886年提出[8]。1992年，Mcinroy等[9]認為植物內生菌是指能夠定殖在植物細胞間隙或細胞內，并與寄主植物建立和諧聯合關系的一類微生物，并首次提出了“植物理內生細菌”的概念，他認為能在植物體內定殖的致病菌和菌根菌不屬于內生菌。近年來，隨著研究領域的不斷拓寬和研究方法的不斷深入，植物內生菌所發揮的重要的生態和生理作用及其作為潛在生防資源和外源基因載體，在農業和醫藥領域中具有巨大應用潛力，已逐漸成為國內外研究的熱點[1]。

1 植物內生菌的來源

關于植物內生菌的來源目前主要有3種假說：(1)垂直傳播，由同種植物經種子傳播；(2)水平傳播途徑，外界微生物將植物細胞纖維素降解破壞植物的細胞壁，進入了宿主植物；(3)從植物側根的裂縫中根際菌進入到植物，經過長期的協同進化，與植物建立了和諧的內生關系，成為內生菌[4～7]。對分離到的植物內生菌分解纖維素情況研究表明，很多內生菌能夠利用纖維素為惟一碳源生長。這說明一些植物內生菌可能是通過分解植物表皮和細胞壁進入植物，并且可能利用植物組織中的纖維素為碳源，以維持生長活動的需要。也有研究結果表明，在長期協同進化過程中，植物有選擇地保留了一些具有重要生態學功能的內生菌菌株，并通過種子進行垂直傳播，從而使后代獲得一些重要的、由內生菌賦予的性狀和功能[1]。

2 植物內生菌的多樣性及其影響因素

植物內生菌是一個龐大的微生物類群，其種類繁多，分布于不同寄主植物的不同部位，因此能產生多種不同的代謝產物，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、殺蟲、免疫抑制、抗氧化和降糖等活性。植物內生菌多樣性是宿主生理狀態的評價標志之一，主要包括內生菌自身種類多樣性、寄主植物種類多樣性、內生菌在寄主植物不同部位分布多樣性[1～4]。

2.1 內生菌種類多樣性

目前全世界已在80多個屬[5,6]中290多種禾本科植物發現有內生菌，對于一種植物而言，從中可分離到的內生真菌和(或)細菌通常為幾種至幾十種，有的甚至多達幾百種[1]。內生真菌存在于目前所有已研究的植物中[1～4]，大多數內生真菌都屬于子囊孢子類(Ascomycetes)，包括核菌綱(Pyrenomyetes)、盤菌綱(Discomyetes)和腔菌綱(Loculoas-comyetes)的許多種類以及它們的一些衍生菌[5]。在多種植物中廣泛分布的幾個屬是半殼霉屬(Leptostroma)、Cryptocline屬、擬隱孢霉屬(Cryptosporipsis)、擬莖點霉屬(Phomopsis)和葉點霉屬(Phyllosticta)[10]。牧草中的內生真菌主要集中在子囊菌亞門麥角菌科瘤座菌族(Balansieae)的Balansia(無性型為Ephelis)和Epichloe(無性型Neotyphodium)2屬[2]。植物內生細菌是十分重要的內生菌資源，能在健康植物組織內定殖，通過多種作用影響植物生長和發育，與植物建立和諧聯合關系[1]。目前已報道在各種農作物及經濟作物中發現的植物內生細菌已超過129種，分屬于54個屬，主要為假單胞菌屬(Pseudomonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、泛菌屬(Pantoea)、基桿菌屬(Methylobacterium)等。現在發現的內生真菌主要為子囊菌類(Ascomycet)及其無性型，包括核菌綱(Pyrenomyetes)、盤菌綱(Discomyetes)和腔菌綱(Loculoascomyetes)等[2]。目前對紅樹林、熱帶多年生樹木及一些藥用作物中植物內生放線菌研究較多，主要為鏈霉菌屬(Streptomyces)、鏈輪絲菌屬(Streptoverticillum)、游動放線菌屬(Antinoplanes)、諾氏卡菌屬(Nocardia)、小單胞菌屬(Micromonospora)[1]。

2.2 宿主種類的多樣性

畢江濤等[11]對沙冬青根瘤菌的研究發現，nodA基因的遺傳多樣性較高，其根瘤菌在結瘤方面具有較寬的宿主范圍。從20世紀70年代后期以來，先后在一些重要的經濟林木如針葉類的各種冷杉(Abiesspp.)、云杉(Piceaasperata)、紅杉(SequoiasempervirensEndll)、松柏(Pinusseylvestris)等以及闊葉的櫟樹(Quercussp.)、樺樹(BetulaL.)、桉樹(Eucalyptusurophyll)等植物樹皮、枝葉內發現內生真菌的存在，并進行了廣泛的研究。后來在多種灌木和草本植物以及栽培作物、果樹甚至藻類、苔蘚和蕨類植物中也發現了內生真菌和內生細菌[4]。目前研究的關于微生態的植物已達上百種[3]，涉及藻類、針葉樹、灌木和草本等多個類群，其中研究較多的植物有牧草、棉花(Gossypiumhirsutum)、小麥(Triticumaestivum)、高粱(Sorghumbicolor)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、甜菜(Betavulgaris)等[2]。

2.3 分布部位的多樣性

內生菌在植物體中的分布具有普遍性、多樣性的特點。在目前研究過的所有植物中均發現有內生菌[4,5]，可存在于植物的根、莖、葉、花、果實、種子等器官和組織的細胞或細胞間隙等各個部位[6,7]。近年來，已從黃瓜(Cucumissativus)、甜菜根、甘藍(Brassicaoleracea)、花生果仁(Archishypogaea)、百慕大草(Bermudagrass)的莖、馬鈴薯的塊莖、種子和胚珠、棉花的胚根、棉鈴和水稻葉及其他植物儲藏器官內分離到大量內生細菌[12]。內生真菌菌絲在宿主植物的葉鞘和種子中含量最多，而葉片和根中含量極少[13]。比較植物不同器官和組織可以發現，不同的內生菌占據不同的生態位。不同植物中分離出的內生菌不同，它們在宿主植物科的水平上具有專一性。并且，內生菌在寄主的種以及組織水平上都存在專一性[14～16]。研究表明，內生菌具有一定組織專一性的原因可能是由于不同的內生真菌具有利用不同基質的能力，從而決定內生真菌具有不同的生活方式[17]。植物內生菌的分布與植物種類、基因型、營養供給、器官、生長階段和環境條件有關[1,2]。

2.4 影響植物內生菌多樣性的因素

隨著植物種類、器官、生長階段和環境條件的不同，其種類、數量會有所不同。不同地區、不同環境下生長的同一種植物組織中存在的內生菌種類和數目均有較大的差異，即使同一地區的同一植物不同組織部位中內生菌的數量和種類也不相同[10,18]；生長速度快的植物比生長速度慢的植物中內生菌數量多；不同植物中分離出的內生菌不同，同一種植物，其內生菌的種類和數量也會隨植株生長時間增加而增多。健康植株比脅迫條件下的植株內生菌的種類和數量多。生物多樣性越豐富的地區植物中內生菌的種類和數量也越豐富，生長在熱帶、亞熱帶地區的植物中內生菌的種類和數量就比生長在干燥、寒冷地區的植物中的要多[3]。我國浙江省農業科學院2003年至2005年對雷公藤(TripterygiunwilfordiiHook)、銀杏、蘆薈、辣椒等的研究表明，內生菌在林木組織中以根部最多，莖部次之，葉部較少，而在一年生和多年生的經濟作物中，根部最多，葉莖中數量相近。生長時間久的植株其內生菌數量比生長時間短的植株多，古老的樹種比其他植物中的內生菌多[19]。而何紅等[20]從辣椒葉內分離到內生細菌的數量高于從根內分離到的細菌。菌根真菌的生長與植物種類、pH、土壤養分有著密切關系，菌根真菌的種類、數量、物種多樣性、種群結構及其功能將隨環境的改變而發生變化[9]。植物內生菌多樣性受宿主植物類型、宿主生長階段、外界環境等影響，并且在植物生長發育過程中起十分重要的作用[1,2]。

3 植物內生菌與宿主的關系

3.1 促進宿主植物的生長

內生細菌存在于植物體內，對植物本身的影響分3類：第一類是中性的，大部分內生細菌都屬于這一類；第二類是有益的；還有一類屬于有害的。植物內生菌與宿主表現出互利共生、無害或微害寄生等關系，并且這些關系可隨多種因素的變化而相互轉化。與宿主植物存在互利共生關系的內生菌能夠促進植物的生長。內生細菌促生作用可分為直接和間接的促生作用，一般情況下，直接促生作用指內生細菌自身代謝產物如植物生長激素(IAA、吲哚乙腈)、赤霉素以及細胞激素等來促進植物生長[1,12]，或者提高寄主植物對環境中營養物質的吸收能力如溶磷能力、固氮作用以及產生鐵載體、產生植物激素等；間接促生作用主要表現在非生物脅迫(抗高溫、抗干旱、抗高鹽)和生物脅迫(抗病蟲害)的抗逆性[5]。非生物脅迫是指通過誘導宿主植物系統性抗性而產生的脅迫，生物脅迫是指通過內生菌分泌抗生物質、競爭生態位、競爭營養物質而產生生防作用。

3.1.1 溶磷解鉀作用

磷肥施入土壤之后易形成難溶性的磷酸鹽，植物對其利用率通常極低。同時，土壤中的鉀元素含量較高，但主要以含鉀礦物的鋁硅酸鹽形式存在，也難以被植物吸收利用。而自然界中某些微生物具有溶磷解鉀作用，這些微生物既有內生菌也有非內生菌，其對植物礦物營養元素的吸收起著重要作用。研究表明，許多微生物能夠將無機磷轉化成可溶性磷或使有機磷發生礦化來促進植物對磷的吸收和利用[12]。

3.1.2 固氮作用

生物固氮是指固氮生物將大氣中的氮氣還原成氨的過程。固氮生物一般為肉眼不可見的微生物，所以，固氮生物又叫做固氮微生物。根據固氮微生物的固氮特性，可以將它們分為共生固氮微生物、自生固氮微生物和聯合固氮微生物3類。關于生物固氮的認識，最初認為某些微生物能夠和豆科植物共生形成根瘤，能夠固氮，促進豆科植物的生長。直至1958年，Dobereine等從甘蔗根中分離得到固氮內生細菌，非豆科植物的內生固氮細菌才逐漸引起學者的關注[5]。自此以后，人們從水稻、玉米、小麥、高粱、甘蔗等非豆科植物中分離到了許多內生固氮菌。

3.1.3 鐵載體作用

鐵是生命體必需的一種營養元素，生命體的呼吸作用、光合作用、氮的固定和核酸的生物合成等眾多生物代謝過程均離不開鐵元素。鐵存在著還原型Fe2+和氧化型Fe3+2種能夠可逆變化的化合態，在自然界中，鐵主要以三價的氧化物或氫氧化物的固態形式存在，形態穩定，不易電離，故生物利用效率較低，因此鐵成為植物生長的一個制約條件。某些微生物能夠合成并分泌一種用于攝取鐵元素的低分子量化合物，稱為鐵載體。大量研究證明，許多植物都可以吸收細菌的鐵載體，對于植物吸收利用鐵離子至關重要，這種方式是此類細菌促進植物生長的一個方面，另一方面則是通過和病原菌爭奪有限的鐵營養，從而抑制病原微生物生長繁殖，起到生物防治作用[21]。

3.1.4 植物激素促生作用

植物內生菌能夠直接合成或者促進宿主合成植物激素來調節植物生長，例如，生長素、細胞分裂素及赤霉素等。生長素即吲哚乙酸(簡稱IAA)對植物的促進作用主要是促進細胞的生長，特別是細胞的伸長。呂澤勛等[22]從水稻組織中分離出1株產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)，可以分泌生長素，對植物的生長發育有著顯著的促進作用。細胞分裂素(cytokinin，CTK)是一類促進胞質分裂的物質，促進多種組織的分化和生長，是調節植物細胞生長和發育的植物激素，與植物生長素協同作用，共同影響植物生長。

3.1.5 抗逆作用

拮抗作用是指一種微生物抑制或殺死其余微生物的現象。根據作用機制的不同，拮抗作用又分為抗生、競爭和重寄生。生活在一起的2種微生物，如果其中一種微生物所產生的物質對另一種微生物有毒害作用，稱為抗生。競爭是指同一微小生物環境中的2種或多種微生物之間爭奪有限空間、營養和氧氣等現象。植物病原菌被其他生物寄生的現象叫重寄生作用。植物修復(Phytoremediation)指的是利用植物超量富集重金屬，然后收割植物處理，達到修復環境的目的。研究表明，植物內生細菌具有提高植物重金屬抗性、增加其吸收重金屬的潛力[23]，增強宿主植物抗逆境、抗病蟲害等作用。內生菌主要通過產生抗生素類物質、水解酶、植物生長調節劑、生物堿，并且與病原菌競爭營養物質和生態位，誘導植物產生抗性等方面增強宿主植物抗逆性和抗病蟲害等作用。

3.2 對宿主植物的毒性作用或抑制作用

內生菌在侵染宿主初期或者在長期的共存中，由于外界環境的改變以及非寄主生物的入侵會產生有毒物質或溶解酶。這種毒性物質和溶解酶一般是非專一性的，會對宿主植物細胞組成、植物的生理功能以及對其敏感的非寄主生物造成毒害損傷或抑制作用，從而促進其生長或是獲取有利的生長空間和營養物質[24]。

3.3 促進宿主植物次生代謝產物的產生

自Stierle等[24]首次從短葉紅豆杉中分離得到1株能合成抗癌物質紫杉醇的紫杉霉屬內生菌，表明有的植物內生菌能生成與宿主植物相同或相似的次生代謝產物，隨后國內掀起了一股從內生菌中篩選與宿主植物相同活性成分的熱潮，陸續從長春花、鳶尾、南方紅豆杉等植物中分離得到了能分泌長春花堿、鳶尾堿、紫杉烷類化合物的菌株[25]。近年來已從植物內生菌中分離出生物堿類、萜類、甾體、有機酸、肽類、酮類和醌類等活性產物[25]。這些活性產物的產生可能是由于內生菌和宿主植物在基因層面的變化產生了信息傳導通路，導致其與宿主產生相同或相似的次生代謝產物；也可能是由于內生菌參與了宿主植物體內的生物合成代謝造成，如內生菌在次生代謝產物的合成途徑中協同或催化關鍵酶類或蛋白的合成[24]。

4 展望

我國地大物博、得天獨厚的地域孕育了十分豐富的植物資源，開發植物內生菌具有廣闊的前景。植物內生菌種類豐富，加之特殊的生存環境，使其成為一類應用前景廣闊的資源微生物。然而與許多內生菌研究較多的國家相比，我國在植物內生菌方面的研究是比較落后的。雖然近些年在植物內生菌的入侵機理、系統學、生態學、資源開發方面展開了一系列的研究，但是仍有許多問題需要進一步探討，如植物內生菌是許多菌構成的微生物群體，而且大多數植物內生菌仍然未被發現，植物內生菌的起源分子機理不清楚，植物內生菌的作用機理不清楚以及植物內生菌作為生防因子無法實際應用，不同生長時期需要怎樣的群落以及何時對植物作用都不清楚等。未來的研究應重視植物內生菌的起源和植物內生菌的作用機理，將傳統培養和非傳統培養的方式結合起來，動態追蹤植物內生菌的動態，以便研究植物內生菌的起源及其作用機理。隨著植物內生菌研究的深入及其在各個領域的應用，必將給人類帶來更多的利益，具有廣闊的開發應用前景。

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