長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老年大鼠主動(dòng)脈中Nrf2介導(dǎo)的抗氧化通路的影響

王 兵 張燕曉 谷 崎

(西安工業(yè)大學(xué)體育學(xué)院，陜西 西安 710032)

血管老化是諸多心血管疾病發(fā)病過(guò)程中的一個(gè)重要風(fēng)險(xiǎn)因子〔1〕，涉及一系列復(fù)雜的血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的改變〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)可以增強(qiáng)心血管適應(yīng)性并減輕衰老相關(guān)的動(dòng)脈硬化和血管內(nèi)皮功能失調(diào)〔3～7〕。然而其中的分子機(jī)制尚未得到完全闡明。研究表明氧化應(yīng)激隨著衰老的過(guò)程在血管系統(tǒng)中越來(lái)越嚴(yán)重〔8，9〕。氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致內(nèi)皮損傷并促進(jìn)粥樣硬化性血管疾病包括心肌缺血、腦卒中、血管性癡呆〔10〕。氧化應(yīng)激指的是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)和活性氧(ROS)生成之間平衡的失調(diào)。血管中ROS的生成主要由NADPH氧化酶催化、線(xiàn)粒體電子傳遞鏈及一氧化氮合酶(NOS)失耦聯(lián)過(guò)程中生成；而抗氧化系統(tǒng)主要由一些抗氧化活性物質(zhì)(如硫化氫、谷胱甘肽等)及一些抗氧化酶系統(tǒng)組成。本文探討長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老年大鼠主動(dòng)脈中核因子E2相關(guān)因子(Nrf)2介導(dǎo)的抗氧化通路的影響。

1 資料與方法

1.1動(dòng)物和試劑 雄性Fisher 344×Brown Norway大鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，上海)，RIPA裂解液(上海碧云天生物科技公司，上海)，RT-PCR試劑盒(Roche羅氏生物試劑，上海)，三氯甲烷、異丙醇、乙醇、甲醇等(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，上海)，羥脯氨酸(HYP)檢測(cè)試劑盒(上海閎巨實(shí)業(yè)有限公司，上海)，組織檸檬酸合成酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，上海)。

1.2動(dòng)物與分組 23月齡大鼠隨機(jī)分為運(yùn)動(dòng)組和非運(yùn)動(dòng)組，2月齡大鼠作為對(duì)照組，每組14只。運(yùn)動(dòng)組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w；第1周適應(yīng)性游泳運(yùn)動(dòng)，每次進(jìn)行60 min的無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)，每2天增加10 min，持續(xù)6天；第2周開(kāi)始，每天進(jìn)行90 min的無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)。每周6 d。持續(xù)運(yùn)動(dòng)12 w。水深0.50 m；水溫(31±3)℃。時(shí)間安排在每天的上午九點(diǎn)左右開(kāi)始進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，平均動(dòng)脈壓(MAP)通過(guò)尾動(dòng)脈測(cè)壓法得到；血糖通過(guò)全生化檢測(cè)儀檢測(cè)而得；分離比目魚(yú)肌，應(yīng)用“組織檸檬酸合成酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒”檢測(cè)檸檬酸合成酶考察運(yùn)動(dòng)的效果。

1.3蘇木素-伊紅(HE)染色 主動(dòng)脈標(biāo)本，4%中性甲醛中固定過(guò)夜，去離子水沖洗。脫水過(guò)程：75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇依次脫水。透明過(guò)程：二甲苯分3次處理。液體石蠟(56℃～58℃)包埋。主動(dòng)脈橫斷面切片(5 μm)，60℃烤片。脫蠟至水過(guò)程：切片二甲苯、無(wú)水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇依次處理。蘇木素染色5～10 min，1%鹽酸酒精溶液分化，50℃～60℃溫水5～10 min顯藍(lán)，伊紅復(fù)染大約2 min。干燥透明過(guò)程：95%酒精、無(wú)水乙醇、二甲苯依次處理；中性樹(shù)脂封固，鏡下觀察并拍照。

1.4HYP檢測(cè) 取大鼠主動(dòng)脈組織，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HYP含量的測(cè)定；組織稱(chēng)重并剪碎，加入水解液1 ml，混勻；加蓋后，置于水浴鍋中，沸水浴加熱水解20 min(期間混勻2～3次，保證水解充分)；用NaOH將pH值調(diào)至6.5左右。根據(jù)試劑盒加入各種檢測(cè)試劑，渦旋混勻；置于水浴鍋中60℃加熱15 min，冰上冷卻后1 000 r/min離心10 min分離上清液，分光光度計(jì)在550 nm處檢測(cè)吸光度值；用HYP標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中的濃度。

1.5內(nèi)皮功能檢測(cè) 取各組大鼠胸主動(dòng)脈，將主動(dòng)脈切成5 mm寬分段，放入含有20 ml Kerbs液浴槽。同時(shí)給予95%O2和5%CO2混合氣體，首先將靜息張力穩(wěn)定在2 g，隨后加入新福林3×10-7mol/L預(yù)收縮，待達(dá)到最大收縮反應(yīng)時(shí)，加入梯度濃度乙酰膽堿(1 nmol/L～10 μmol/L)，觀察其對(duì)血管平滑肌的舒張反應(yīng)。

1.6Western印跡分析 組織蛋白提?。篟IPA裂解液使用前加入1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，0.5 mmol/L EDTA和蛋白酶抑制劑，主動(dòng)脈剪碎，加入0.5 ml組織裂解液，電動(dòng)勻漿；4℃ 22 500 r/min離心10 min，收集上清，后再離心1次，取上清。Bradford法測(cè)蛋白濃度檢測(cè)上清液蛋白含量。按蛋白含量添加4倍上樣緩沖液，調(diào)整蛋白量濃度到合適范圍，100℃水浴鍋中加熱10 min變性蛋白質(zhì)，分裝后-80℃保存。制膠，每孔加入20 μg蛋白溶液，60 V電泳0.5 h，120 V電泳待待測(cè)蛋白到達(dá)合適位置為止。100 V濕法電轉(zhuǎn)膜；加麗春紅染色觀察蛋白條帶，考察轉(zhuǎn)膜效果；PVDF膜印跡顯色；10%脫脂奶粉封閉非特異性免疫反應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)；加入一抗，4℃條件下孵育過(guò)夜；加入二抗，室溫孵育2 h；加入電子發(fā)光(ECL)底物，用保鮮膜包裹，平放于X光片曝光盒；曝光，制片；高像素掃描儀掃描目的條帶，Bandscan軟件進(jìn)行灰度值定量，以GAPDH蛋白作為內(nèi)參蛋白校正最終結(jié)果。

1.7RT-PCR 主動(dòng)脈組織剪碎，Trizol法提取總RNA，依次通過(guò)三氯甲烷、異丙醇、乙醇分離出總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到單鏈DNA；利用SYBRGreen I染料在MJ Research Option2熒光定量PCR儀上檢測(cè)NAPDH醌氧化還原酶(NQO)1、谷氨酸半胱氨酸連接(GCLC)、血紅素加氧酶(HMOX)-1的表達(dá)。引物序列：HMOX-1正義鏈5′TTG TCT CTC TGG AAT GGA AGG3′,反義鏈5′CTC TAC CGA CCA TTC TG3′;NQO1正義鏈5′TGG GAT ATG AAT CAG GGA GAG3′,反義鏈5′GAG AGG TAA CTA ATA GCA ACA AG3′;GCLC正義鏈5′GCT TTC TCC TAC CTG TTT CTT G3′,反義鏈5′TGG CAG AGT TCA GTT CCG3′;GAPDH正義鏈5′GAG CTG AAT GGG AAG CTCA C3′,反義鏈5′AAA GGT GGA GGA GTG GGA GT3′。反應(yīng)體系是：10倍PCR緩沖液2.5 μl，4 μl的MgCl2(25 mmol/L)，1 μl dNTP(10 mmol/L)，0.5 μl 20×SYBR Green，1 μl引物(12.5 mmol/L)，0.3 μl的Taq DNA聚合酶 (1.5 U)，1 μl cDNA，加去離子水補(bǔ)足，使體系的總體積為25 μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min預(yù)變性，然后是40個(gè)循環(huán)反應(yīng)(94℃ 30 s變性，56℃ 30 s退火，72℃ 45 s延伸)，4℃ 1 h結(jié)束。記錄CT值，GAPDH作為內(nèi)參基因校正最終結(jié)果。

1.8二氫乙啶(DHE)染色 DHE可自由透過(guò)活細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并被細(xì)胞內(nèi)的活性氧氧化，繼而形成氧化乙啶；氧化乙啶可與染色體DNA結(jié)合并產(chǎn)生紅色熒光。胸主動(dòng)脈冰凍包埋并切片5 μm，10 μmol/L的DHE溶液37℃避光孵育0.5 h。熒光顯微鏡下觀察紅色熒光并拍照。組織的熒光強(qiáng)度通過(guò)ImageJ軟件分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老年大鼠一般狀態(tài)的影響 與對(duì)照組大鼠相比，老年大鼠體重和血壓明顯增加，肌肉中檸檬酸合酶活性和血糖濃度變化不明顯。老年大鼠經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)后，體重明顯下降，肌肉中檸檬酸合酶活性增加，MAP降低(均P<0.05)，而血糖濃度變化不明顯(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老年大鼠一般指標(biāo)的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，與非運(yùn)動(dòng)組比較：2)P<0.05，下表同

2.2長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老年大鼠主動(dòng)脈功能的影響 與對(duì)照組大鼠相比，老年大鼠主動(dòng)脈厚度/長(zhǎng)度比值明顯增加，主動(dòng)脈厚度明顯增加，提示老年大鼠的主動(dòng)脈出現(xiàn)增厚；HYP含量明顯增加，提示老年大鼠的主動(dòng)脈中纖維含量明顯增加(均P<0.05)；老年大鼠主動(dòng)脈對(duì)乙酰膽堿刺激引起的內(nèi)膜依賴(lài)的舒張反應(yīng)明顯減弱，提示老年大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮功能的下降。老年大鼠經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)后，主動(dòng)脈厚度/長(zhǎng)度比值和主動(dòng)脈厚度下降，HYP含量減少，主動(dòng)脈對(duì)乙酰膽堿刺激引起的內(nèi)膜依賴(lài)的舒張反應(yīng)明顯增強(qiáng)，提示長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)可以減輕年老大鼠主動(dòng)脈肥厚、纖維化及內(nèi)皮功能下降。見(jiàn)圖1，表2。

2.3長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)上調(diào)老年大鼠主動(dòng)脈Nrf2通路 與對(duì)照組大鼠相比，老年大鼠主動(dòng)脈中Nrf2蛋白表達(dá)明顯減少，NQO1、GCLC、HMOX-1 mRNA水平明顯降低，提示老年大鼠主動(dòng)脈中Nrf2介導(dǎo)的抗氧化通路明顯下調(diào)。老年大鼠經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)后，主動(dòng)脈中Nrf2蛋白表達(dá)增加，NQO1、GCLC、HMOX-1 mRNA水平明顯增加，提示長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)可以激活老年大鼠主動(dòng)脈中Nrf2介導(dǎo)的抗氧化系統(tǒng)。見(jiàn)圖2，表3。

圖1 各組大鼠主動(dòng)脈病理學(xué)觀察(HE，×100)

表2 長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老年大鼠主動(dòng)脈功能的影響

圖2 各組大鼠主動(dòng)脈Nrf2蛋白表達(dá)

表3 長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老年大鼠主動(dòng)脈中Nrf2通路的影響

2.4長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)抑制老年大鼠主動(dòng)脈中ROS生成 與對(duì)照組大鼠相比，老年大鼠主動(dòng)脈DHE染色的熒光強(qiáng)度明顯增加，提示老年大鼠主動(dòng)脈中ROS生成明顯增加，發(fā)生了明顯的氧化應(yīng)激；長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)后，老年大鼠主動(dòng)脈DHE染色的熒光強(qiáng)度明顯降低，提示長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)可以減輕老年大鼠主動(dòng)脈中氧化應(yīng)激的發(fā)生。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠主動(dòng)脈DHE染色(DHE，×100)

3 討 論

本課題的研究發(fā)現(xiàn)Nrf2蛋白在老年大鼠主動(dòng)脈中表達(dá)下調(diào)。Nrf2蛋白是調(diào)控細(xì)胞和組織內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要因子，在機(jī)體各器官系統(tǒng)中均有表達(dá)。Nrf2蛋白在核定位因子介導(dǎo)幫助下進(jìn)入細(xì)胞核，該蛋白的Neh1結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞核內(nèi)的Maf蛋白結(jié)合，接著又與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，在Neh4和Neh5結(jié)構(gòu)域的協(xié)助下與cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)結(jié)合，最終啟動(dòng)ARE結(jié)構(gòu)域調(diào)控的下游基因轉(zhuǎn)錄〔11〕。我們已知的Nrf2下游基因達(dá)到上百種，其中與氧化應(yīng)激相關(guān)的抗氧化類(lèi)蛋白有GCLC、硫氧還原酶、硫氧還蛋白還原酶、半胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、HMOX-1，過(guò)氧化物歧化酶、NQO1、半胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶、UDP葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶等〔12〕。本研究發(fā)現(xiàn)GCLC、HMOX-1、NQO1 mRNA表達(dá)在老年大鼠主動(dòng)脈中表達(dá)也發(fā)生了明顯下調(diào)。在年輕動(dòng)物的細(xì)胞中，ROS的過(guò)度生成可以負(fù)反饋性地激活Nrf2/ARE抗氧化通路。然而在老年大鼠的血管中，過(guò)度生成的ROS無(wú)法激活Nrf2/ARE抗氧化通路，從而使得老年大鼠的血管面對(duì)ROS的損傷更加敏感〔13〕。因此衰老破壞了負(fù)反饋循環(huán)中Nrf2的功能，從而加劇了衰老過(guò)程中ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。

在血管平滑肌細(xì)胞中高表達(dá)Nrf2蛋白可以抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，對(duì)抗氧化性低密度脂蛋白誘導(dǎo)的損傷〔14〕。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)Nrf2可以對(duì)抗過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用并抑制腫瘤壞死因子(TNF)α和白細(xì)胞介素(IL)-1β誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞超化因子(MCP)-1和血管細(xì)胞間黏附分子(VCAM)1的表達(dá)〔15〕。在動(dòng)脈粥樣硬化模型中，Nrf2蛋白的缺失可以通過(guò)抑制HMOX-1的表達(dá)從而加劇病變的發(fā)生〔16，17〕，提示在血管中Nrf2及其下游的抗氧化通路對(duì)血管保護(hù)具有重要意義。

運(yùn)動(dòng)對(duì)Nrf2/ARE通路的調(diào)節(jié)作用近年研究越來(lái)越多。短期的運(yùn)動(dòng)(1 h左右)對(duì)Nrf2的影響并不明顯；而較長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)(6 h左右)就會(huì)明顯激活骨骼肌內(nèi)的Nrf2/ARE通路〔18〕。本研究顯示長(zhǎng)期有規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)可以恢復(fù)主動(dòng)脈中Nrf2的蛋白表達(dá)，從而提高其下游的抗氧化通路，這對(duì)于解釋長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)在老年人群中的血管保護(hù)作用具有重要意義。

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