microRNA-31對胃癌細胞系AGS遷移的影響

孫玉成 金恩鴻

(延邊大學附屬醫院普外一科，吉林 延吉 133000)

胃癌早期很難被發現，發展到晚期時有較高的轉移率，這也是胃癌死亡率高的重要原因之一〔1〕。文獻報道，胃癌的發生主要是由遺傳和環境等多因素所致〔2〕。microRNA(miRNA)是由內源基因轉錄的約22個核苷酸的非編碼單鏈RNA，在基因組中高度保守且在基因表達的調節過程中具有組織特異性和時間性〔3〕。目前發現的miRNAs與人類腫瘤的形成及發生發展密切相關〔4〕。研究報道microRNA(miR)-31通過抑制TIAM1促進結腸癌細胞的侵襲和轉移〔5〕。在乳腺癌細胞中，miR-31通過靶向特異AT序列結合蛋白(SATB)2基因抑制乳腺癌的遷移和浸潤〔6〕。然而，MiR-31對胃癌細胞遷移的作用未見報道。本研究采用實時定量(qRT)-PCR檢測miR-31在胃癌組織中的表達水平，并通過體外實驗驗證miR-31對胃癌細胞系AGS遷移的影響。

1 材料和方法

1.1主要試劑和儀器 qRT-PCR試劑盒購自瑞士ROCHE公司，逆轉錄試劑盒購自北京全式金(TRANSGENE)公司，RNA裂解液Trizol Reagent購自日本TaKaRa公司，RPMI1640培養液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素購自美國Gibco公司，Lipofectamine2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，Transwell小室購自美國Corning Costar公司。MiR-31模擬物(miR-31mimics)購自廣州銳博生物公司。紫外可見分光光度計、倒置熒光顯微鏡及照相機、BioRad CFX-96型號的PCR儀、生物安全柜和二氧化碳培養箱〔MCO-18AIC(UV)〕等，分別購于德國eppendorf公司、日本OLYMPUS公司和尼康公司、美國BIO-RAD公司、江蘇凈化和日本三洋公司等。

1.2細胞培養和轉染 胃上皮細胞系GES-1、胃腺癌細胞系AGS、SGC7901、MGC、BGC、HGC均購于中國科學院上海細胞庫，其中人胃癌細胞HGC是未分化的胃腺癌細胞系。細胞培養于10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養液中，放入37℃、5%CO2培養箱中培養。取對數期細胞按3×105個/孔鋪6孔板，24 h后進行瞬時轉染，轉染體系按照Lipofectamine2000的說明制備轉染液，將轉染miR-31mimics組設為實驗組，未經處理的胃癌細胞組設為對照組，對照組成分為轉染試劑和廣州銳博生物公司合成的無義RNA片段。加入轉染液后6 h對細胞換液處理，轉染48 h后進行下一步處理。

1.3胃癌組織樣本 收集2015年1～12月延邊大學附屬醫院胃腸外科胃癌患者27例的胃癌組織和對應的正常組織，液氮保存。18例術前經過化療和放射治療，未經過治療的有9例。男15例，女12例，年齡27～63歲，平均(42.70±9.05)歲。腫瘤組織樣本的收集均經過患者的同意且腫瘤組織樣本切片均已經過病理學證實。

1.4RNA的提取定量 采用RNA裂解液Trizol Reagent裂解細胞，按照Trizol提取總RNA的說明書提取胃癌組織和對應正常組織中總RNA。體外培養GES-1、AGS、SGC7901、MGC、BGC、HGC 6種細胞系，待細胞生長至對數期時提取細胞系中的總RNA。用TE做標準體進行定量，測定得總RNA的濃度，-80℃保存。

1.5逆轉錄反應 將上述提取的總RNA吸取2.0 μg，按照逆轉錄試劑盒說明書先將RNA逆轉錄為cDNA(42℃ 30 min，85℃ 5 min)，逆轉錄反應體系：2×TS Reaction Mix 10.0 μl，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1.0 μl，Oligo(dT)1.0 μl，總RNA 2.0 μg，RNase-free Water補足至20.0 μl。

1.6qRT-PCR反應 采用莖環法測量miRNA的相對表達量，所用引物購自廣州銳博生物科技有限公司，檢測組織樣本中GES-1、AGS、SGC7901、MGC、BGC、HGC中miR-31的表達量。將上述cDNA進行50倍稀釋，采用ROCHE相對定量試劑盒進行目的基因的定量。通過ct值進行相對定量的計算。qRT-PCR主要體系：反應體系SYBR Premix EX TapⅡ10 μl，Primer mix 2.0 μl，cDNA 2.0 μl，ddH2O 6 μl。

1.7細胞劃痕實驗 在未接種細胞的培養板后面做好標記，轉染48 h后細胞均勻鋪滿整個12孔板，待細胞長滿板底后，用已滅菌的尺子和10 μl槍頭進行劃痕，在整個劃痕過程中保持快速均勻，使劃出的痕道大小一致，棄掉培養板中培養液，在此過程中盡量把劃掉的細胞全部吸出，加入全新培養液，拍照記為0 h；并分別在12、24、36、48 h進行拍照觀察。

1.8Transwell小室實驗 將已轉染的AGS細胞進行趨化計數處理，采用無血清培養液調整AGS細胞濃度，在聚碳酸酯膜上室接種已轉染的AGS細胞3×104/100 μl，嵌入24孔板上，在24孔板加入500 μl含有20%的FBS培養液作為趨化劑，放入培養箱內培養24 h后，將小室內細胞擦拭掉，用0.4%的多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，然后在顯微鏡下觀察并計算遷徙通過的細胞數，找穿過細胞數符合比例的視野進行拍照。

1.9統計學方法 應用SPSS18.0軟件行配對樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-31在胃癌組織中的表達水平 miR-31在胃癌組織中的表達水平為(0.23±0.03)，明顯低于對應正常組織的(0.36±0.04，t=13.510，P=0.000)。(以U6為內參，2-ΔΔCt法定量)。

2.2qRT-PCR檢測細胞系中miR-31的表達水平 以GES-1的miR-31的表達量(1.00)為對照，胃癌細胞系AGS、SGC7901、MGC、BGC、HGC中miR-31呈低表達，分別為(0.59±0.08)，(0.19±0.04)，(0.60±0.13)，(0.32±0.08)，(0.49±0.07)，與GES-1比較差異均有統計學意義(t=3.514，8.214，3.241，8.214，3.954；均P=0.000)，其中AGS細胞內的表達水平最低(以U6為內參，2-ΔΔCt法定量)。

2.3檢測miR-31瞬時轉染AGS細胞系的表達 在miR-31表達水平較低的AGS細胞內轉染miR-31mimics，結果提示，與對照組(1.00)相比，實驗組中表達水平(8.2±1.5)顯著升高(t=11.521，P=0.000)(以U6為內參，2-ΔΔCt法定量)。

2.4過表達miR-31對AGS細胞遷移的影響

2.4.1劃痕實驗 miR-31mimics和對照組分別轉染AGS細胞36 h后，實驗組遷移距離(310.0±11)μm明顯小于對照組(690.0±0.2)μm(t=30.121，P=0.000)，提示miR-31抑制AGS細胞的遷移水平。見圖1。

2.4.2Transwell小室實驗 對照組上穿過的細胞多于實驗組，證明過表達miR-31抑制AGS細胞的遷移水平。見圖2。

圖1 劃痕實驗中過表達miR-31對AGS細胞遷移水平的影響(×200)

3 討 論

胃癌的發生發展是個多基因互相調控的過程，基因的表達主要通過各種調節機制的影響以及表觀遺傳學的改變，主要概括為抑癌基因失活和原癌基因的激活。miRNA是一類在機體起重要調控作用的非編碼RNA，占人類基因的1%，調控著人類近30%的基因表達〔7〕。關于miRNA在胃癌中的功能研究已有很多報道，其轉錄后的調控網絡幾乎參與了各項生理活動，包括細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等過程〔8〕。

本課題主要在胃癌組織中檢測miR-31的表達水平，闡釋miR-31在胃癌發生發展中的作用。miR-31作為miRNA家族的一員，在多種腫瘤組織中表達異常，通過與靶基因mRNA的3′UTR區域結合，調控靶基因的表達。本研究使用qRT-PCR的方法檢測組織中miR-31的表達水平，發現miR-31的低表達可能與胃癌的發生發展有關。

文獻報道〔9〕，與正常組織相比，miR-31在卵巢癌細胞和前列腺癌細胞中呈低表達，在卵巢癌細胞中，miR-31能夠抑制腫瘤細胞的增殖，通過天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)介導促進細胞的凋亡。在前列腺癌細胞中，miR-31可以通過介導E2F6增強前列腺癌細胞系的耐藥性〔10〕。miR-31可能作為一個抑癌基因存在于胃癌組織細胞中。本研究通過劃痕實驗和Transwell小室實驗證明，在胃癌細胞系AGS細胞中過表達的miR-31可以抑制AGS細胞的遷移，而其作用機制有待繼續研究。在乳腺癌細胞中，已經被證實miR-31通過靶向SATB2、RhoA、ITGA5和RDX等基因抑制乳腺癌的遷移和浸潤〔6，11〕。在卵巢癌細胞中，miR-31抑制卵巢癌細胞的遷移和克隆形成〔12〕。暗示了miR-31很有可能作為一個重要調控因子參與胃癌遷移過程。在整個遷移過程中，同一種miRNA在不同腫瘤細胞中不一定有相同的作用，而作用的靶點也不一定是同一個靶點，還應進一步證實miR-31參與胃癌遷移的作用機制，尋找miR-31作用機制過程中的重要靶點。

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11王文江.新輔助化療對晚期乳腺癌患者血漿microRNA及腫瘤相關指標的影響〔J〕.海南醫學院學報，2015；21(11)：1509-11，1515.

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