南五味子多糖急性毒性及對小鼠肝損傷保護作用機理探討＊

顏志婷，肖冬梅，陳杰

南五味子系藤本植物，包括多糖、木脂素、揮發(fā)油等活性成分，具有補腎寧心、益氣生津等功效，現(xiàn)代藥理學認為，五味子的活性成分能夠抗癌、抗氧化、保肝等，其中北五味子多糖對于小鼠肝臟有顯著的保護作用，能夠使小鼠肝臟因四氯化碳造成的肝損傷減輕，并能較好地保護大鼠因CC14所致的肝損傷[1，2]。不過臨床上關(guān)于南五味子的毒性及保肝作用，相關(guān)研究較少，因此研究分析南五味子多糖的急性毒性反應(yīng)及對急性小鼠肝損傷的保護作用以為臨床對南五味子的應(yīng)用提供有利依據(jù)具有重要意義[3，4]。本研究探討分析南五味子多糖急性毒性及對小鼠肝損傷保護作用機理，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 儀器選擇 ⑴德國徠卡儀器有限公司生產(chǎn)的RM2235型石蠟切片機、SI5020型自動染色機、DM4000B型生物顯微鏡；⑵安徽中科中佳科學儀器有限公司生產(chǎn)的HC-2062型高速離心機；⑶廣東美的微波電器有限公司生產(chǎn)的EG823MF4-NA型微波爐；⑷德國歐寶有限公司生產(chǎn)的XL600型全自動生化分析儀；⑸上海精密儀器科學有限公司生產(chǎn)的7225B型紫外可見分光光度計；⑹北京丹佛儀器有限公司生產(chǎn)的S-114型電子分析天平；⑺廣州旭朗機械設(shè)備有限公司生產(chǎn)的HK-02A型手提式粉碎機。

1.2 試藥 ⑴自制的南五味子多糖提取物；⑵廣州科方生物技術(shù)有限公司提供的ALT和AST試劑盒；⑶天津市大茂化學儀器供應(yīng)站提供的四氯化碳；⑷萬邦德制藥集團股份有限公司生產(chǎn)的聯(lián)苯雙脂滴丸；⑸其他試劑均為國產(chǎn)分析純，水為蒸餾水。1.3實驗動物 本次研究實驗動物包括SPF級昆明種小鼠80只，購自南昌大學醫(yī)學部實驗動物中心。

1.4 方法

1.4.1 南五味子多糖提取 將100g干燥的南五味子粉末放入30倍量水中，置入微波爐，設(shè)定溫度80℃，進行30min的提取，然后將之進行過濾，濃縮濾液到200ml，放入3倍量95%乙醇醇沉過夜，采用Sevage法將蛋白去除，經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析純化處理，最終獲得南五味子多糖。

1.4.2 南五味子多糖含量測定 取100mg葡萄糖，葡萄糖在105℃下干燥至恒重，將之放入蒸餾水中進行溶解，并在100ml量瓶之中定容，配制成為1.0mg/ml的葡萄糖對照品貯備液。對該貯備液分別精 密 吸 取 1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml 放 入25ml的量瓶中，定容至刻度。取干燥具塞試管將之分別移取1ml于其中，取5%苯酚、98%濃硫酸分別加入每支試管，苯酚加入1.0ml，濃硫酸加入5.0ml，將其搖勻之后放置于30℃的水浴中進行30min的反應(yīng)，完成后冷卻至室溫，測吸光度于波長490nm處，以吸光度作為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。精密稱取25mg南五味子多糖放入水中溶解，并將之于100ml量瓶中定容。取干燥具塞試管將多糖溶液移取1ml于其中，取5%苯酚、98%濃硫酸加入試管，苯酚加入1.0ml，濃硫酸加入5.0ml，將其搖勻之后放置于30℃的水浴中放置30min，完成后冷卻至室溫，測吸光度于波長490nm處，最后帶入標準曲線對多糖含量進行計算。

1.4.3 急性毒性試驗 精密稱取20g南五味子粗多糖溶解于適量蒸餾水中，并將之定容至100ml的量瓶中備用。取10只雌性小鼠和10只雄性小鼠，在12h的禁食處理之后將之隨機分為空白對照組10只和南五味子多糖組10只，空白對照組給予等容積蒸餾水，南五味子多糖組在24h內(nèi)以最大體積40ml/kg灌胃給藥3次，進行14d的持續(xù)觀察。觀察記錄小鼠體質(zhì)量等變化，若小鼠死亡立即進行解剖觀察，包括心肝脾肺腎等臟器變化，若病理異常實施組織切片檢測。

1.4.4 急性肝損傷保護作用試驗 采用0.5%CC14致小鼠急性損傷模型，取60只小鼠隨機分為南五味子低劑量（347mg/kg）、中劑量（694mg/kg）、高劑量（1388mg/kg）組，CC14模型對照組，空白對照組，聯(lián)苯雙酯組 （22.5mg/kg）。南五味子不同劑量的3各組和聯(lián)苯雙酯組均以40ml/（kg·d）的量灌胃1次，而空白對照組和模型對照組則給予等容積蒸餾水，進行6d的連續(xù)給藥。除空白對照組外的其他組均對小鼠注射0.5%CC14菜籽油溶液，每只注射0.2ml，造模之后進行16h的禁食，不禁水。對小鼠實施麻醉后于眼眶取血，447×g離心20min，將血清分離后采用ALT、AST試劑盒進行檢測。在對小鼠取完血之后立即實施解剖操作，取心肝脾肺腎等臟器并將臟器表面血液吸干后稱重，對臟器指數(shù)進行計算。

1.4.5 病理切片觀察 取小鼠肝右葉使用10%的福爾馬林固定，取材作常規(guī)石蠟切片，5μm左右的切片厚度，HE染色，在顯微鏡下對小鼠肝組織病理學變化進行觀察。

1.5 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20.0軟件包統(tǒng)計分析，以（x±s）表示計量資料，行 t檢驗，采用百分比表示計數(shù)資料，行χ2檢驗。P＜0.05說明組間數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 南五味子多糖試驗結(jié)果 經(jīng)葡萄糖回歸方程分析得出葡萄糖在40～200μg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，通過計算得出南五味子多糖含量為17.36%。急性毒性試驗顯示所有小鼠均正常，隨著觀察之間的增加小鼠體質(zhì)量也隨之增加，未出現(xiàn)死亡情況。

2.2 南五味子對小鼠臟器的影響 在實驗中小鼠無異?；顒颖憩F(xiàn)，解剖小鼠未見臟器異常變化，空白對照組與其他給藥組在臟器指數(shù)上比較無明顯差異（P＞0.05）。 見表 1。

表1 南五味子對小鼠臟器影響比較（x±s）

2.3 南五味子對小鼠急性肝損傷保護作用 模型對照組AST、ALT水平對空白對照組顯著更高（P＜0.05），南五味子多糖不同劑量的3個組與模型對照組比較ALT顯著降低（P＜0.05），而高劑量和中劑量組AST水平顯著降低（P＜0.05）。見表2。

表2 南五味子對小鼠急性肝損傷后ALT和AST的影響比較（x±s）

3 討論

有毒物質(zhì)所引起的肝臟損傷及各種病因?qū)е碌募毙愿尾】墒垢渭毎l(fā)生炎癥或壞死，并繼發(fā)纖維化的病理過程，因此要預(yù)防或延緩肝纖維化的形成就需要使各損傷因素減少，對肝細胞進行保護。臨床研究認為五味子的活性成分能夠抗癌、抗氧化、保肝等，其中北五味子多糖對于小鼠肝臟有顯著的保護作用，能夠使小鼠肝臟因四氯化碳造成的肝損傷減輕，不過對于南五味子多糖的急性毒性和保肝作用的相關(guān)研究較少，故而探究南五味子多糖急性毒性及對小鼠肝損傷保護作用具有重要意義[5，6]。

南五味子在中藥護肝領(lǐng)域之中發(fā)揮了巨大作用，臨床研究認為其具有以下作用：其一，南五味子能夠促進膽汁的分泌，使肝內(nèi)有毒物質(zhì)加速排泄；其二，南五味子中富含多種活性成分，這些活性成分能夠使SOD、GSH-Px等酶的生物活性增強，具有促進蛋白質(zhì)生物合成、抗脂質(zhì)過氧化、促進肝糖原生成、保護肝細胞膜等作用；其三，南五味子能夠促進肝臟解毒過程，使肝臟受到良好保護，并能夠使受損肝臟組織再生；其四，南五味子能夠使外界因素導(dǎo)致肝組織中不斷升高的轉(zhuǎn)氨酶有效降低[7，8]。

本研究分析比較分析南五味子多糖急性毒性及對小鼠肝損傷保護作用機理，結(jié)果顯示南五味子多糖能夠使CC14致小鼠急性肝損傷后的ALT和AST水平明顯降低，使小鼠肝臟損傷得到有效改善，證實了南五味子多糖對小鼠肝損傷有保護作用，同時急性毒性實驗結(jié)果顯示各組小鼠均未發(fā)生中毒情況，說明南五味子多糖還具有較高的用藥安全性。

綜上所述，南五味子多糖無明顯的毒性作用，同時在一定程度上能夠保護CC14致小鼠急性肝損傷。

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