復方丹參黏附微丸對黏膜刺激性研究

趙夢迪，黎丹奇，陳笑南，喻剛艷，白 潔，李鵬躍，陸 洋，杜守穎

0 引言

將現代新型制劑技術用于傳統名方，是中藥現代化的一條重要途徑。復方丹參方是臨床治療冠心病的名優處方。近年文獻報道，復方丹參制劑可引起不良反應[1-3]。胃腸不良反應是口服復方丹參制劑的常見不良反應之一[4-5]，可能是因為方中佐使藥冰片藥性寒涼，久服可能傷胃。相關動物實驗也表明，冰片大劑量或者長期服用時會刺激胃黏膜，造成胃部不適[6]。本課題組前期用β-環糊精包合佐使藥冰片，采用現代技術，將名優處方復方丹參方制成黏附微丸，增加藥物在胃腸道的停留時間，以期提高其生物利用度。但是，黏附微丸中的黏附材料在胃腸道停留時間較長，也有可能造成黏膜刺激性，因此，本實驗以冰片不包合的黏附微丸和普通復方丹參黏附微丸為參比，考察黏附材料是否會對黏膜產生刺激性以及復方丹參黏附微丸中冰片經包合后，是否能降低對胃腸道的刺激。

1 材料

1.1 儀器與試劑 自制灌胃器，勻漿機(常州恒隆儀器有限公司)，臺式高速冷凍離心機(上海天美生化儀器設備有限公司)，Multiskan Go型酶標儀(美國Thermo Fisher)，96孔板(美國Corning Iocorporated)，手術剪及鑷子，OLYMPUS BX51型顯微鏡(日本)。普通復方丹參微丸，復方丹參冰片包合黏附微丸，復方丹參冰片不包合黏附微丸，空白黏附微丸(以上制劑均為實驗室自制，批號：20160612)。純凈水(娃哈哈集團有限公司)，PBS溶液(索萊寶)，氯化鈉(西隴化工股份有限公司，AR分析純)，LDH試劑盒(南京建成)，MDA試劑盒(碧云天)，脫氧膽酸鈉(索萊寶)。

1.2 動物 SPF級的SD雄性大鼠45只，體重240～260 g [北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2012-0001]。中華大蟾蜍36只，體重40～50 g (江蘇振興蟾業)。

2 實驗方法

2.1 體外實驗[7]體外蟾蜍上顎纖毛毒性實驗方法：取蟾蜍36只，隨機分為6組：空白對照組(KB)，陽性對照組(SD)，普通復方丹參制劑組(PT)，復方丹參冰片不包合黏附微丸組(NBNF)，復方丹參冰片包合黏附微丸組(BNF)，空白黏附微丸組(CL)，每組6只。除空白對照組和陽性對照組，其余組別給藥量為藥物粉末0.5 g/只。

將蟾蜍仰臥并固定于蛙板上，用止血鉗使其口腔張開，防止其閉合和吞咽。同時，將各組藥物分別用少量水潤濕，空白對照組滴加0.5 g生理鹽水，陽性對照組滴加0.5 g的1%去氧膽酸鈉溶液，其余組別給藥量為相應微丸粉末0.5 g/只。將藥粉平鋪于蟾蜍上顎，滴加適量水浸潤藥物，給藥0.5 h后，用生理鹽水沖凈藥物。然后用眼科剪和眼科鑷分離上顎黏膜，取約大小5 mm×5 mm的黏膜，黏膜分離后立即用生理鹽水洗去血污及雜物。將取得的黏膜纖毛面向上平鋪于載玻片上，于黏膜表面滴加少量生理鹽水使之浸潤，輕輕蓋上蓋玻片，于光學顯微鏡下觀察纖毛運動情況。每次觀察完畢，立即將黏膜置于預先用少量蒸餾水飽和的培養皿中，密閉，環境溫度為25 ℃。每隔適當的時間取出上顎標本，于光學顯微鏡下觀察，如纖毛持續運動，則放回培養皿中，直至纖毛停止運動。

記錄從開始給藥到纖毛停止運動的時間，即纖毛持續運動時間(Persistent vibration duration，PVD)。通過比較PVD值，評價不同制劑對上顎纖毛的毒性，PVD越長，表明毒性越小。

2.2 體內方法 45只大鼠隨機分為5組：空白對照組(KB)，普通復方丹參微丸組(PT)，復方丹參冰片不包合黏附微丸組(NBNF)，復方丹參冰片包合黏附微丸組(BNF)，空白黏附微丸組(CL)，每組9只。各組大鼠均采用灌胃給藥，給藥量為2.4 g/(kg·d)。每組大鼠隨機平均分為3批，第1批給藥1周后立即處死，第2批給藥2周后立即處死，第3批給藥4周后立即處死。大鼠處死后觀察胃、腸黏膜變化，并對其胃、腸黏膜進行病理切片觀察，以及MDA、LDH試劑盒檢測。

2.2.1 大鼠病理切片評價 分別于灌胃給藥后1、2、4周后脫頸椎處死大鼠，解剖獲取大鼠胃、腸黏膜，觀察胃、腸黏膜是否出血，是否有非正常分泌物、結構層次是否清晰等，然后將大鼠胃、腸黏膜用10%的甲醛固定，經取材、固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、貼片以及HE染色和封片操作制成胃、腸黏膜病理切片，光鏡下觀察胃黏膜的層次結構、炎細胞浸潤程度等。

2.2.2 胃、腸黏膜氧化損傷及細胞毒性測試 各組大鼠于灌胃給藥2、4周后脫頸椎處死，解剖獲取10%胃、10%腸組織勻漿，按MDA、LDH試劑盒方法測定胃、腸組織中MDA含量和LDH含量。

3 實驗結果

3.1 體外評價結果 各組在體蟾蜍上顎纖毛毒性實驗結果：與KB組比較，PVD結果如圖1。在體蟾蜍上顎黏膜纖毛毒性觀察結果見圖2，KB組上顎纖毛清晰，完整，擺動活躍；SD組觀察到蟾蜍纖毛不清晰，無運動狀態；CL組、BNF組、NBNF組、PT組均能觀察蟾蜍上顎纖毛清晰，擺動活躍，如圖2。

通過對各組藥物對蟾蜍上顎黏膜纖毛運動時間影響的數據分析發現，SD組PVD小于KB組，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，其余各組PVD略小于空白對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)，3種復方丹參黏附微丸組的PVD值雖略有變化，但各組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。結果表明，本課題組制備的復方丹參黏附微丸中的黏附材料和各種復方丹參微丸對胃腸道無顯著刺激性。

3.2 體內評價部分

3.2.1 病理切片及結果 脫頸椎處死大鼠后，解剖觀察大鼠胃、腸黏膜，各組大鼠胃、腸黏膜均無充血現象，沒有觀察到明顯的異常分泌物，顏色鮮亮粉嫩，未見纖維增生，未見泡狀細胞增生，而且層次結構清晰。圖3～圖14分別為連續給藥1、2、4周后大鼠的胃、腸黏膜病理切片圖。

圖1 蟾蜍上顎纖毛運動時間(PVD)

圖2 各組給藥 30 min 后蟾蜍上顎纖毛結構(400×)

圖3 連續給藥1周的胃黏膜病理切片圖(100×)

圖4 連續給藥1周的胃黏膜病理切片圖(400×)

圖5 連續給藥1周的腸黏膜病理切片圖(100×)

圖6 連續給藥1周的腸黏膜病理切片圖(400×)

圖7 連續給藥2周的胃黏膜病理切片圖(100×)

圖8 連續給藥2周的胃黏膜病理切片圖(400×)

圖9 連續給藥2周的腸黏膜病理切片圖(100×)

圖10 連續給藥2周的腸黏膜病理切片圖(400×)

圖11 連續給藥4周的胃黏膜病理切片圖(100×)

圖12 連續給藥4周的胃黏膜病理切片圖(400×)

圖13 連續給藥4周的腸黏膜病理切片圖(100×)

由顯微鏡(100×)可知，連續給藥1、2、4周后，與KB組比較，CL、NBNF、BNF、PT組大鼠胃、腸黏膜無明顯改變，結構層次完整、清晰；由顯微鏡(400×)可知，連續給藥1、2、4周時，與KB組比較，CL、NBNF、BNF、PT組大鼠胃、腸黏膜均無明顯改變，未見纖維增生，也未見炎細胞浸潤和泡狀細胞增生。結果表明，連續給藥1、2、4周后，黏附材料及復方丹參黏附均無明顯刺激性。

3.2.2 胃、腸組織氧化損傷及細胞毒性測試結果 由表1、表2可見，連續給藥2、4周后，CL、NBNF、BNF、PT組胃腸的MDA、LDH濃度與KB組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，表明黏附材料并未對胃腸道造成顯著刺激，冰片包合/不包合復方丹參黏附微丸對胃腸道也無顯著刺激性。

4 討論

蟾蜍上顎纖毛毒性實驗結果顯示，顯微鏡下空白黏附微丸、普通復方丹參微丸、復方丹參冰片包合黏附微丸、復方丹參冰片不包合黏附微丸組均能看到清晰纖毛，且擺動活躍，PVD比較結果顯示，各微丸組PVD略低于空白對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)。通過大鼠胃、腸黏膜肉眼觀察、病理切片、氧化損傷及細胞毒性測試實驗，可發現本實驗所考察的空白黏附微丸及3種復方丹參微丸均未改變大鼠胃、腸黏膜表面形態，未見纖維增生，也未見炎細胞浸潤和泡狀細胞增生等病理變化。分析可能主要存在2個原因：①復方丹參制劑中的冰片含量不大，黏膜對此劑量不敏感，有報道，服用復方丹參制劑產生刺激性，可能是少數的個別體質原因；②服用時間較短，本實驗對大鼠灌胃給藥1個月，低劑量冰片長期服用可能會造成輕微刺激性，這有待進一步考察。實驗結果顯示，復方丹參黏附微丸中所用黏附材料及用量比例，對胃、腸黏膜沒有顯著刺激性，復方丹參冰片不包合黏附微丸及復方丹參冰片包合微丸對大鼠胃、腸道也無顯著刺激，以上實驗結果為復方丹參黏附微丸的進一步研究奠定了基礎。

表1 給藥后胃、腸組織MDA濃度(μmol/L)

表2 給藥后胃、腸組織LDH濃度(μmol/L)

刺激性評價多為外用制劑或鼻腔給藥劑型的重要評價內容，口服制劑的胃腸道刺激性研究較少，本課題前期針對復方丹參制劑中冰片性寒，有可能存在黏膜刺激性的問題，采用β-環糊精冰片包合，一方面可以減少對人體的刺激性；另一方面又可以提高冰片在制劑中的穩定性[8]。為了提高藥物的生物利用度，課題組在實驗前期對不同黏附材料及用量進行了考察，將復方丹參方制備成黏附微丸[9]，并對處方中冰片體外溶出行為進行了對比研究[10]。

本研究結果表明，復方丹參黏附微丸中黏附材料及冰片包合前后制備的復方丹參黏附微丸對胃、腸黏膜無顯著性刺激，為復方丹參方新劑型的開發提供參考。

[1] 趙冉,古麗艷,王淳.1994-2014年復方丹參注射液不良反應病案文獻分析[J].中醫藥導報,2016,22(4):63-66.

[2] 李佰玲.復方丹參注射液不良反應的回顧性研究[J].中醫學報,2014,29(8):1184-1185.

[3] 劉林增.復方丹參滴丸的不良反應與合理應用效果評價[J].中國醫藥指南,2016,14(21):179-180.

[4] 李少春,馬麗娜,郝新梅,等.復方丹參滴丸不良反應分析[J].中藥藥理與臨床,2016,32(1):171-174.

[5] 宋良斌,雷招寶,柳青.復方丹參滴丸的不良反應與合理應用[J].中成藥,2010,32(12):2157-2159.

[6] 胡利民,樊官偉,高秀梅,等.天然冰片、合成冰片對大鼠胃黏膜屏障影響的比較[J].天津中醫學院學報,2005,24(3):123-125.

[7] 程艷珂,郭懿望,尚可心,等.以溶解度與刺激性為指標篩選葛根素滴鼻液溶劑及增溶劑[J].中國中藥雜志,2014,39(22):4335-4339.

[8] 郭麗蓉,周莉玲.冰片β-環糊精、羥丙基-β-環糊精包合物的制備及穩定性[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(8):7-10.

[9] 趙壯,杜守穎,陸洋,等.卡波姆等6種生物黏附材料體內外黏附性能評價[J].中國藥學雜志,2014,49(24):2188-2192.

[10]王振,杜守穎,陸洋,等.復方丹參腸黏附微丸中龍腦含量測定方法的建立及不同劑型龍腦溶出度的研究[J].中國中藥雜志,2015,40(16):3194-3199.