七氟烷后處理對失血性休克巴馬小型豬肝功能和BHMT、IL-6、TNF-α的影響

楊竹君,孫永進,刁玉剛,張鐵錚,孫瑩杰*

0 引言

失血性休克后，肝臟是較易受傷的器官之一，一方面，由于肝的有效循環血容量減少，導致肝組織的灌注不足，引起肝細胞的代謝功能異常。另一方面，肝臟的解剖學和組織學特征也易導致肝臟受到傷害[1]。七氟烷因其諸多優點目前廣泛應用于臨床，既往研究結果表明，七氟醚可減輕失血性休克豬腦損傷[2]和腸黏膜屏障損傷[3]，但是目前關于七氟烷對失血性休克后肝臟損傷的保護作用尚未定論。本實驗通過觀察七氟烷后處理對失血性休克巴馬小型豬血清中BHMT、ALT、TNF-α、IL-6、血乳酸濃度及對肝臟病理組織學變化的影響，旨在探討七氟烷后處理對失血性休克肝損傷的保護作用及可能機制，為減輕失血性休克后器官損傷和并發癥的發生提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康成年巴馬小型豬24頭，雌雄不限，體重(23±2)kg，按隨機數字表法分為3組，每組8頭。對照組(S組)，麻醉后股動脈置管，頸內靜脈置管后,觀察6 h；失血性休克組(HS組)，麻醉置管后建立失血性休克模型，觀察4 h；七氟烷組(Sev組)，麻醉置管后，待巴馬小型豬清醒后建立失血性休克模型，建模成功后吸入2%七氟烷30 min，觀察4 h。本研究動物由沈陽軍區總醫院醫學實驗動物科提供，并經醫院倫理委員會同意。

1.2 巴馬小型豬失血性休克(HS)模型的建立 巴馬小型豬，術前禁食12 h，不禁水；皮膚清潔處理，術區備皮；術前取耳緣靜脈穿刺。每頭豬靜脈給丙泊酚3.0 mg/kg，待實驗動物豬呼吸減慢，肢體活動逐漸消失，角膜反射遲鈍至逐漸消失，迅速進行氣管內插管。麻醉成功后,將巴馬小型豬固定在手術臺上，用七氟醚維持麻醉，接通麻醉機和呼吸監測儀；調整呼吸機參數，術中吸入2%七氟醚維持麻醉，手術部位備皮，碘伏消毒。左側頸內靜脈穿刺順行留置7F中心靜脈導管三腔,連接測壓裝置和輸液器;左側股動脈切開置管用于采血、放血及血氣分析，以監測血紅蛋白(Hb)、動脈血氧分壓(PaO2)、動脈血氧飽和度(SaO2)和血乳酸等。操作結束后，停止吸七氟醚。用麻醉氣體監測設備監測MAC，待MAC值監測為0時，進行模型制備。采用文獻[4]方法建立豬容量控制性HS模型，待動物清醒后自左股動脈于15 min 內將約40%的血容量(全身血容量按30 mL/kg計算)勻速放出，制備HS模型,穩定60 min認為模型制備成功。

1.3 樣本采集及檢測 各組分別在造模前(T0)、失血性休克后0.5 h(T1)、失血性休克后1 h(T2)、失血性休克1.5 h(T3)、失血性休克2 h(T4)、失血性休克3 h(T5)和失血性休克4 h(T6)等7個時間點采集血液標本，3 000 r/min離心5 min，取上清液，-80 ℃保存，備用。待失血性休克模型制備成功4 h后，將豬處死，取肝右葉部分組織，用福爾馬林液固定，剩余肝組織放入-80 ℃冰箱保存。用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中BNMT的變化，具體步驟按說明書進行，用ELISA試劑盒檢測血清中IL-6、TNF-α含量變化，應用全自動生化分析儀檢測血清中的ALT，應用血氣分析機檢測外周動脈血中的乳酸含量。 將肝組織放入福爾馬林液(中性)中固定，24～48 h后將肝組織取出，用流水沖洗4～5次，將肝組織用濾紙浸干后，經梯度酒精(70%、80%、90%、95%、100%)脫水，二甲苯透明，浸蠟3 h，包埋蠟塊，切片機切片，厚約5 μm，37 ℃烤箱過夜；脫蠟，行HE染色，采用中性樹膠封片，光鏡(×400，Olympus公司，Et本)下觀察肝組織病理學結果。

2 結果

2.1 一般情況 各組動物實驗前的體重、身長、體表面積和放血量等比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組巴馬小型豬實驗前一般情況(n=8)

2.2 各組肝臟病理組織學變化 S組肝小葉結構無異常，肝小葉中央未見充血。肝臟細胞的細胞質均勻染色，細胞核染色適度，無核濃縮。HS組小葉中央肝臟可見空泡樣變形且聚集成簇，多數肝細胞的細胞核濃縮且深染，呈現壞死樣改變。門管區可見大量的炎性細胞浸潤。Sev組肝細胞輕度水腫，門管區浸潤炎性細胞較HS組少，見圖1。

2.3 肝臟功能的變化 血清BHMT和ALT含量的變化:與T0時比較，HS組、Sev組血清BHMT濃度在T1～T2時點，ALT濃度在T1～T3時點無顯著變化(P>0.05)；血清BHMT濃度在T3～T6時點，ALT濃度在T4～T6時點均顯著升高(P<0.05)，且一直呈持續上升趨勢，見表2。組間比較，與S組相比，HS組、Sev組血清BHMT濃度在T3～T6時點明顯升高，血清ALT濃度在T4～T6時點明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。Sev組血清BHMT濃度在T3～T6時點明顯降低，血清ALT濃度在T4～T6時點明顯降低，差異有統計學意義(P< 0.05)，見表2。

2.4 血清TNF-α和IL-6含量的變化 與T0時比較，HS組、Sev組血清TNF-α濃度在T1時點，IL-6濃度在T1、T2時點無顯著變化(P>0.05)；血清TNF-α濃度在T2～T6時點均顯著升高(P<0.05)，且在休克后2 h達到峰值，然后呈下降趨勢；血清IL-6濃度在T3～T6時點均顯著升高(P<0.05)，且一直呈持續上升趨勢，見表3。

組間比較，與S組相比，HS組、Sev組血清中TNF-α濃度在T0、T1時點，血清IL-6濃度在T0～T2時點的差異無統計學意義(P>0.05)；血清TNF-α濃度在T2～T6時點，血清IL-6濃度在T3～T6時點均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。Sev組血清TNF-α濃度在T2～T6時點，血清IL-6濃度在T3～T6時點明顯低于HS組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

2.5 血清乳酸含量的變化 與T0時比較，HS組和Sev組血清Lac濃度在T1時點無顯著變化(P>0.05)；在T2～T6時點均顯著升高(P<0.05)，且一直呈持續上升趨勢，見表3。

圖1 各實驗組肝臟病理組織學變化(HE染色,400×)

時間S組BHMTALTHS組BHMTALTSev組BHMTALTT0295±3030±5309±4033±5295±3028±3T1301±3034±5317±3935±5302±3030±6T2298±2937±7300±4536±4315±3135±7T3302±3042±6409±47*△45±6356±39*△#51±8T4305±3238±5491±46*△101±5*△412±43*△#73±12*△#T5292±2735±6519±45*△146±5*△434±42*△#94±11*△#T6304±3142±5589±51*△171±4*△517±47*△#134±13*△#

注：與T0時比較，*P<0.05；與S組比較，△P<0.05；與HS組比較，#P<0.05

表3 各組巴馬小型豬各時點血清TNF-α濃度和IL-6濃度的比較(n=8)

注：與T0時比較，*P<0.05；與S組比較，△P<0.05；與HS組比較，#P<0.05

結果顯示，與S組相比，HS組和Sev組在T0～T1時點血清Lac濃度差異無統計學意義(P>0.05)，而T2～T6時點兩組血清Lac濃度均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。Sev組在T2～T6時點血清Lac濃度明顯低于HS組，且差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 各組巴馬小型豬各時點血清Lac濃度的比較(n=8)

注：與T0比較，*P<0.05；與S組比較，△P<0.05；與HS組比較，#P<0.05；

3 討論

參照國內外成功經驗，大多數學者認為，巴馬小型豬的生理特征與人更加接近；結合相關文獻和預實驗的結果發現，容量控制性HS模型無論是血流動力學上的變化還是生化指標的改變都更接近于失血性休克的病理狀態[5]。因此，本實驗的實驗動物采用巴馬小型豬，失血性休克模型采用容量控制性HS模型。

失血性休克時，由于機體的神經-體液調節作用，導致腸道的血運急劇減少，腸黏膜屏障受損，引發腸道菌群移位，細菌和內毒素入血，于是肝臟的損傷首當其沖[6]。另外，來自腸道的內毒素作用于肝臟的Kupffer細胞，該細胞較其他部位的巨噬細胞更容易活化，產生炎性因子，釋放氧自由基，損傷臨近的肝細胞[7]。但是肝臟具有強大的代償功能和再生功能，以及傳統的肝功能檢測不能及時、敏感地反映肝臟損傷，因此肝臟的損傷在臨床上并未引起應有的重視[8]。

臨床上最常用的反映肝細胞受損、膜通透性改變生化指標主要是ALT和AST。ALT有2種同工酶，s-ALT和m-ALT，前者(約11%)存在于線粒體上，后者存在于肝細胞胞漿內。ALT肝細胞內的濃度為血清內濃度的1 000～3 000倍，因此，該指標反映肝臟損傷有很好的靈敏性，故成為目前臨床上診斷肝臟損傷的金標準[9]。而AST、ALP、GGT等反映肝臟損傷，無論是敏感性方面還是特異性方面均不理想。因此，目前對反映肝臟損傷的敏感性及特異性生化檢測指標臨床上仍有著實際的需求[10]。而傳統的肝功能檢測指標AST、ALT、LDH均未達到該標準。BHMT存在于細胞的胞漿內，在肝臟組織和腎臟組織中均有表達。BHMT前期的研究文獻表明，該蛋白是臨床上反映肝臟損傷的一個理想指標[11]。

七氟烷溶解度低，刺激性小，麻醉誘導平穩，麻醉維持中機體血流動力學穩定，在體內清除代謝迅速[12-13]，故廣泛應用于臨床。隨著臨床缺血再灌注的病例增多和臨床上對七氟烷的廣泛應用，發現七氟烷對缺血再灌注的器官具有保護作用，其機制可能與七氟烷抑制炎癥介質釋放相關[14-15]。Catania等[16]的研究也發現，七氟烷可以使缺血再灌注肝臟損傷大鼠的血清中AST、ALT濃度顯著降低。本實驗研究結果顯示，兩組于休克后2 h，血清中ALT的含量出現顯著降低，血清中的BHMT濃度于失血性休克1.5 h后出現顯著的升高，并呈持續升高狀態。

失血性休克引起巴馬小型豬肝臟損傷的機制較為復雜，受多種不同因素的影響。既往研究表明，過度的炎癥反應是引起肝臟損傷的重要因素之一。失血性休克時，源于腸道的細菌、內毒素和炎癥因子作用于肝臟的枯否氏細胞，后者被激活，儲存并釋放更多的炎癥因子，其中最主要的炎癥因子包括TNF-α和IL-6等[17]，這些炎癥因子對失血性休克肝臟損傷起到關鍵性的作用，可直接引起肝竇細胞膜的損傷和肝功能的異常。且TNF-α又可刺激中性粒細胞產生氧自由基和損傷性酶類，進一步加重肝臟的損傷。本研究結果顯示，與HS組對比，Sev組休克后1.0 h，血清中TNF-α的含量均出現顯著降低；兩組血清中IL-6含量于1.5 h均出現顯著降低。該結果提示，吸入一定濃度的七氟烷有利于減少炎癥細胞對炎癥因子的釋放，減輕肝臟的炎癥反應。

失血性休克時,應激反應亦是引起肝臟損傷的另一個重要的危險因素[18]，源于應激狀態下的神經體液調節，機體血糖增高，同時伴有低血容量和組織乏氧，故血糖代謝大部分處于無氧酵解途徑，乳酸則是糖無氧酵解的產物，血乳酸含量可以間接地反映末梢循環的狀態,組織的缺氧程度以及糖代謝狀況。既往研究表明，異氟醚可較好地降低失血性休克小白鼠模型中血糖和血乳酸的濃度[19]，一定程度地抑制失血性休克引起的應激反應，對失血性休克肝臟損傷起到保護作用。而目前國內外針對七氟烷對應激狀態下肝臟能量代謝影響的研究尚不確切。本研究結果顯示，Sev組于休克后1.0～4.0 h，血清中Lac的含量均顯著低于HS組，提示吸入一定濃度的七氟烷有利于緩解組織氧供的相對不足，減少血乳酸的含量。與此同時，與HS組對比，Sev組于休克后4 h肝臟病理組織學損傷較輕。上述結果提示，七氟烷可通過抑制應激反應，降低Lac濃度，改善肝臟的能量代謝，從而對失血性休克肝臟損傷起到保護作用。

綜上所述,七氟烷對失血性休克巴馬小型豬肝臟損傷的保護作用，可能是通過抑制應激反應和炎癥反應，從而減輕失血性休克對肝臟的損傷，其確切機制還有待于進一步研究。

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