成年似鲇高原鰍外周血細胞及血細胞發生的觀察

趙柳蘭，代 敏，楊 淞，吳應斌，湯巨平，楊世勇，杜宗君

(1.四川農業大學動物科技學院，成都 611130；2.四川省似鲇高原鰍省級原種場，四川峨眉山 614224)

似鲇高原鰍 (Triplophysasiluroides)屬鯉形目(Cypriniformes)鰍科(Cobitidate)條鰍亞科(Nemachilinae)高原鰍屬(Triplophysa)，是中國特有的冷水性魚類，能夠適應于青藏高原特殊的高寒環境，為鰍科中最大的一種，主要分布于四川、甘肅、青海的黃河干支流及附屬湖泊[1]。似鲇高原鰍肉質鮮美，具有較高經濟價值，由于環境變化、分布的局限性及生長慢等原因，幾乎瀕臨滅絕。似鲇高原鰍對高原環境有著極強的適應性，而如今卻很難養殖，這與其免疫適應性的機制密切相關。到目前為止，似鲇高原鰍的研究較少，如遺傳多樣性[1]、呼吸耗氧[2]及苗種培育[3]等方面的初步研究，而免疫學方面僅見皮膚和鰓粘膜免疫結構[4]及部分細菌性病原的分離[5]，其他方面幾近空白。血細胞是細胞免疫的基礎，承擔著免疫應答的重要機能，并且能夠隨外界環境因素的影響而發生變化，反映機體的健康和所處環境狀況，也能夠為其疾病防治提供重要依據[5,6]。本研究通過對似鲇高原鰍的外周血細胞、中腎、肝臟和脾臟的血細胞發生進行研究，以期為揭示似鲇高原鰍免疫適應性原因及今后該種類的合理保護和養殖開發提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗用魚

似鲇高原鰍源自眉山似鲇高原鰍原種場，充氧后運回實驗室，暫養于水族箱內，24 h不間斷充氧，水溫13 ℃左右，選取體色正常、反應靈敏的10尾個體(雌雄比1∶1)進行取樣，平均體重為(93.12±12.73)g，平均體長為(22.08±1.91)cm。

1.2 實驗方法

采血制作血涂片和取中腎、肝臟、脾臟組織制作印片并染色。

1.2.1 制片

血涂片的制備：用MS-222將魚體麻醉，注射器尾靜脈采血，制作血涂片。用生理鹽水將血液稀釋200倍后，在Neubauer計數板上完成血細胞計數。每尾魚制作15張血涂片，室溫晾干。

組織印片的制備：解剖似鲇高原鰍，取出中腎、肝臟及脾臟組織，生理鹽水沖洗并用吸水紙吸干，橫切，制取印片。每尾魚每種組織制作15張印片，室溫晾干。

1.2.2 細胞形態觀察與計數

制作好的血涂片和組織印片用新配的2.5%戊二醛固定，Wright’s染色，中性樹膠封片，在Olympus100倍鏡下觀察并拍照。每張涂片和印片隨機選取10個視野，進行血細胞分類、計數。各種細胞均選取30個，用Image-Pro Plus 6.0軟件進行細胞和細胞核大小(長徑×短徑)測定，結果用平均值±標準差(Mean ± SD)表示。

每張組織印片上隨機取10個視野，對其中的各類細胞都分為原始型、幼稚型及成熟型進行統計，各類細胞均統計，總計5 000個，分別計算其所占的百分比，并測量印片上細胞的大小，不同類型細胞分別測量200個，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析，其細胞大小用平均值 ± 標準差(Mean ± SD)表示。

1.2.3 細胞化學特性的觀察

血涂片的化學染色參照Shigdar等[6]的方法。

過碘酸雪夫染色(periodic-acid schiff，PAS)主要著染糖原，陰性對照采用唾液淀粉酶消化處理，陽性反應多糖部分被染成紅色。

蘇丹黑B(sudan black B，SBB)主要著染脂肪，陰性對照用丙酮處理，陽性反應有黑斑出現，表示有脂類物質存在。

1.2.4 細胞類型及發育階段的判定

細胞形態、類型和發育階段的判定參照Fijan[7]的標準。

2 結果

2.1 似鲇高原鰍血細胞的比例及大小

在外周血涂片中可見成熟的紅細胞、粒細胞、淋巴細胞、單核細胞及血栓細胞，少見晚幼紅細胞，偶見無法辨別的細胞(約占白細胞中的比例為0.21%)；外周血細胞研究發現似鲇高原鰍總血細胞數(THC)為1.39×1012個/L，紅細胞占97.56%，白細胞占2.44%。外周血中各種白細胞細胞比例血栓細胞為最大，為52.86%，三種粒細胞中嗜中性粒細胞數量最多占30.25%，具體見表1。而在肝臟、中腎和脾臟中可見不同發生階段的紅細胞系、粒細胞系、淋巴細胞系和單核細胞系。在以上組織中，紅細胞系在脾臟中所占比例最大，粒細胞在中腎中所占比例最大，其次是脾臟，肝臟中未見原始型血細胞，具體見表1。似鲇高原鰍外周血及組織中血細胞大小見表2。

2.2 似鲇高原鰍血細胞的形態特征

2.2.1 紅細胞系各階段細胞形態特征

原紅細胞(proerythroblast，PEB)：圓形或橢圓形，偶有鈍的偽足，細胞質較少且不均勻，被染成深藍色。胞核為圓形，占細胞絕大部分，中位，偶有偏位，周圍有一圈淺染環帶區，深紫紅色的染色質呈網狀，核仁為藍色，但邊界不明顯，較平坦或有凹陷感。(圖版Ⅱ-1)

表1 似鲇高原鰍外周血及組織中各種血細胞的比例Tab.1 Percentage of various blood cells in the peripheral blood and tissues of T.siluroides

注：外周血一欄中血細胞均為成熟的血細胞，且嗜中性、嗜堿性 、嗜酸性粒細胞，單核細胞，淋巴細胞比例為占白細胞中的比例

表2 似鲇高原鰍外周血及組織中血細胞及其核的大小(平均值 ± 標準差)Tab.2 Cell and nucleus sizes of various haematopoietic cells in the peripheral blood and tissues in T.siluroides(Mean ± SD) /μm

續表2

早幼紅細胞(basophilic erythrocyte，BEB)：胞體和胞核均稍小于原紅細胞，胞質為藍色或灰藍色。胞核為圓形，仍占細胞絕大部分，中位或稍偏，淺染的環帶區依舊存在，紫紅色染色質逐漸聚集，形成更粗糙的網狀結構，核仁小且逐漸消失。(圖版Ⅱ-2)

晚幼紅細胞(orthochromic erythroblast，OEB)：圓形，胞質由灰藍色逐漸變為桔黃色或磚紅色。胞核為圓形，此時縮小，稍偏一側，染色質固縮成塊狀，間隙模糊不清。(圖版Ⅱ-3)

紅細胞(erythrocyte，E)：成熟的紅細胞為橢圓形或長橢圓形，表面光滑，胞質為磚紅色。胞核多為橢圓形偶有圓形，中位，濃密的染色質染成深紫紅色，無核仁，偶爾可見正處于分裂狀態的紅細胞。(圖版Ⅰ-1～3；圖版Ⅱ-4～8)

2.2.2 粒細胞系各階段細胞形態特征

原粒細胞(granuloblast，GB)：圓形或橢圓形，與原紅細胞相似，常有鈍的偽足，胞質少且不含顆粒，染成藍色。胞核圓形或橢圓形，位置居中或稍偏，細沙狀的染色質分布均勻，核仁外凸，邊界明顯。(圖版Ⅱ-9)

粒細胞的發育階段可分為早幼、中幼、晚幼、成熟粒細胞(圖版Ⅱ-10～19)，具體如下：

早幼粒細胞(young netrophilic progranulocyte，YPG)：圓形或橢圓形，胞質稍多，淡藍色，有淺紫紅色的嗜天青顆粒出現，由早期至晚期逐漸增多，顆粒大小不一。胞核為圓形或橢圓形，偏位，核質比大于二分之一，染色質逐漸由細沙狀變為粗砂狀，核仁不清晰。(圖版Ⅱ-10)

中幼粒細胞(progranulocyte，PG)：圓形或橢圓形，淺藍色的胞質更為豐富，胞質中的特殊顆粒因化學性質不同而呈現不同的顏色，被染成淺粉色的是嗜中性中幼粒細胞(neutrophilic progranulocyte，NPG)(圖版Ⅱ-11)，覆蓋著深藍色顆粒的是嗜堿性中幼粒細胞(basophilic progranulocyte，BPG)(圖版Ⅱ-14)，染成紅色的是嗜酸性中幼粒細胞(eosinoopilc progranulocyte，EPG)(圖版Ⅱ-17)。胞核為橢圓形，偏位，核質比約為二分之一，核仁完全消失。

圖版Ⅰ 似鲇高原鰍外周血細胞Plate Ⅰ Peripheral blood cells of T.siluroides

1.E.成熟紅細胞；2.DE.正在分裂的紅細胞；3.OEB.晚幼紅細胞；4.NG.嗜中性粒細胞；5.BG.嗜堿性粒細胞；6.EG.嗜酸性粒細胞；7.M.單核細胞；8.LL.大淋巴細胞；9.SL.小淋巴細胞；10.TH.血栓細胞；11.TH.聚集成群的血栓細胞；12.A.未知細胞；標尺 = 10 μm。

晚幼粒細胞(metagranulocyte，MG)：圓形或橢圓形，胞質豐富，淺藍色，依據特殊顆粒的顏色可分為嗜中性晚幼粒細胞(圖版Ⅱ-12)、嗜堿性晚幼粒細胞(圖版Ⅱ-15)和嗜酸性晚幼粒細胞(圖版Ⅱ-18)。胞核固縮成橢圓形、腎形或馬蹄形等不規則形狀，位置偏于細胞一側，染色質聚集成塊狀。

嗜中性粒細胞(neutrophilic granulocyte，NG)：細胞呈圓形，胞質內充滿細小的無色中性顆粒。胞核形態多樣，為不規則的圓形、桿狀或分葉狀，偏于細胞一側。(圖版Ⅰ-4；圖版Ⅱ-13)

嗜堿性粒細胞(basophilic granulocyte，BG)：細胞多為圓形，胞質呈淺藍色，有大小不一的嗜堿性顆粒。胞核為扁橢圓形、桿狀或分葉狀，偏位，染色質致密。(圖版Ⅰ-5；圖Ⅱ-16)

嗜酸性粒細胞(eosinoopilc granulocyte，EG)：細胞呈圓形或橢圓形，胞質為淡橘紅色，有細小的橘紅色顆粒。胞核形態多樣，有腎形、長橢圓形和分葉形，常偏于細胞一側。(圖版Ⅰ-6；圖版Ⅱ-19)

2.2.3 單核細胞系各階段細胞形態特征

原單核細胞(monoblast，MB)：圓形或不規則形，體積是三系白細胞中最大的，胞質灰藍色或淺藍色，不發亮呈網狀，常有偽鈍足，偶有空泡出現。胞核形狀多樣，常扭曲、折疊成不規則形狀，分布有不均勻的紫紅色纖細染色質，核仁清晰。(圖版Ⅱ-20)

幼單核細胞(promonocyte，PM)：圓形或橢圓形，體積稍小于原單核細胞，胞質增多，為灰藍色，常出現偽足或副漿，網狀，少有空泡，出現少量細小的紫紅色的嗜天青顆粒。胞核形狀不規則，常扭曲、折疊或分葉，染色質開始聚集成網狀，但仍較纖細，核仁不明顯。(圖版Ⅱ-21)

單核細胞(Monocyte，M)：細胞呈圓形，體積稍小，胞質為灰藍色，多有空泡和細小顆粒。細胞核不規則，折疊、扭曲或分葉，可呈馬蹄形或大腸狀，核質比較大，染色質凝集呈粗網狀。(圖版Ⅰ-7；圖版Ⅱ-22)

2.2.4淋巴細胞系各階段細胞形態特征

原淋巴細胞(lymphoblast，LB)：圓形，表面不光滑，有偽足伸出，胞質很少，為深藍色，近核處有一淺染的環帶區，核周界明顯。胞核形狀多樣，有圓形或腎形，幾乎占據整個細胞，居中或略偏一旁，染色質是三系細胞中最粗糙的，呈粗網狀，核仁清晰 ，有凹陷感。(圖版Ⅱ-23)

幼淋巴細胞(prolymphocyte，PL)：圓形或橢圓形，有偽足，胞質稍多，深藍色，有嗜天青顆粒出現。胞核為圓形或偶有凹陷，染色質粗糙且緊密，染成紫紅色，核仁逐漸消失。(圖版Ⅱ-24)

淋巴細胞(lymphocyte，L)：細胞呈圓形，胞體表面凹凸不平，胞質為淡藍色，有少許嗜天青顆粒。核多不規則，幾乎占據整個細胞，染色致密。(圖版Ⅰ-8，9；圖版Ⅱ-25)

2.2.5 血栓細胞

血栓細胞(Thrombocyte，TH)：細胞呈橢圓形、紡錘形或不規則形，個體較小，細胞核大，有時幾乎看不到胞質，像一個裸露的細胞核，通常聚集成群。(圖版Ⅰ-10，11；圖版Ⅱ-26)

2.3 似鲇高原鰍血細胞的化學特征

對似鲇高原鰍外周血細胞和組織進行化學染色，結果見圖版Ⅲ。結果表明過碘酸雪夫(PAS)染色顯示，紅細胞均為陰性；所有白細胞的胞質均染成紅色，為陽性。但不同種類的白細胞著色程度有所區別，淋巴細胞和血栓細胞都呈深紅色，呈強烈陽性；單核細胞和嗜堿性粒細胞次之；嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞著色較淺，呈弱陽性。蘇丹黑B(SBB)染色結果顯示嗜中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞呈棕黑色，顯陽性，但顏色的深淺根據細胞的成熟度逐漸增加。紅細胞和血栓細胞均呈陰性。(圖版Ⅲ)

3 討論

3.1 血細胞發生場所

對于血細胞發生場所的研究，不同的魚類結果有所差異。如長鰭裸頰鯛(Lethrinuserythropterus)[8]、暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)[9]和美國紅魚(Sciaenopsocellatus)[10]血細胞的主要發生場所在頭腎和中腎；而齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)[11]、日本黃姑魚(Nibeajaponica)[12]、軍曹魚(Rachycentroncanadum)[13]等大多數魚類血細胞發生的主要場所除頭腎和中腎外還有脾臟。金麗[14]通過對長吻鮠(Leioeasislongirostris)肝臟組織印片的研究，沒有觀察到原始型血細胞，認為其可能不是造血器官；長鰭裸頰鯛[8]和泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[15]的情況與之相似。由此可見，大多數魚類血細胞發生場所主要由頭腎、中腎和脾臟組成。本研究發現成年似鲇高原鰍腎臟是粒細胞和淋巴細胞的主要發生場所，脾臟中可見較多的原始單核細胞，肝臟中未見原始型血細胞，可能不是成年似鲇高原鰍的造血器官。岳興建[16]認為硬骨魚類頭腎和腎臟的形態類型多樣，本課題組經過大量的解剖實驗，發現成年似鲇高原鰍頭腎幾乎未見，至于頭腎是否為其主要的造血器官還有待進一步研究。

3.2 血細胞發育的規律

血細胞的發育規律通常可分為原始、幼稚和成熟三個階段。

似鲇高原鰍紅細胞的發育過程從原紅細胞經幼紅細胞再到成熟紅細胞，胞體形態由圓形變為橢圓形，體積先由大變小，再由小變大，胞質由少變多，顏色由深藍逐漸變淺，直至粉紅色，胞核由大到小，染色質逐漸固縮成塊。完成功能后的紅細胞直接分裂，產生兩個衰老的紅細胞或一個衰老的紅細胞和一個紅細胞胞質小體，這與日本黃姑魚[12]、長吻鮠[14]和大彈涂魚[17]等研究類似。

似鲇高原鰍粒細胞的發育可分為原始粒細胞、早幼粒細胞、中幼粒細胞、晚幼粒細胞和成熟粒細胞五個階段，除原始和早幼階段，又根據胞質內的特殊顆粒將之分為中性、酸性和堿性[18]。粒細胞的發育過程中，胞體由大變小，胞核由圓形變為橢圓形、腎形、桿狀或分葉型，核質比由大逐漸變小，這與日本黃姑魚[12]、長吻鮠[14]和大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)[17]的變化過程相同。不同魚類的三種粒細胞存在情況是有差異的，如長吻鮠[14]、泥鰍[15]血細胞中未見嗜堿性粒細胞，軍曹魚[13]未見嗜酸性粒細胞，齊口裂腹魚[11,19]外周血中兩者均未見到。本研究發現似鲇高原鰍存在三種粒細胞，大量嗜中性粒細胞和少量的各階段的嗜堿性和嗜酸性粒細胞，這與日本黃姑魚[12]一致。嗜中性粒細胞是最常見的粒細胞[20]，具趨化、吞噬作用及活躍的運動能力[6]，似鲇高原鰍外周血細胞中嗜中性粒細胞所占比率高達30.25%，這對似鲇高原鰍的免疫抗病能力具有重要作用。

3.3 其他細胞

在本研究中還發現了3個核的細胞(圖版Ⅱ-27)和疑似吞噬細胞的細胞(圖版Ⅱ-28)，與王鳳計發現的人類白血病[21]中的幼稚淋巴細胞和吞噬細胞的形態一致，編者認為是由淋巴造血組織增生引起的。而目前研究比較多的是紅細胞的核分裂及變形現象，認為是這種核的表面積增大，有利于核孔的物質核信息交流，或者是一種程序性衰老的現象[22]，似鲇高原鰍此類細胞的出現是否暗示著也具有淋巴細胞快速增生的能力或者是某種細胞衰老有待進一步研究。而在外周血的研究中偶見無法辨別的細胞，這種細胞比紅細胞體積更大，細胞核染色質較疏松，但是數量極少，與金麗[14]描述的形態多樣的核影細胞類似，并且在齊口裂腹魚[11]、斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[7]等魚中也出現類似細胞，推測可能與人為因素(如采血的方法、涂片的速度及抗凝劑有無等)或實驗魚個體生理狀況不同有關[7,14]。

3.4 似鲇高原鰍外周血細胞與發生血細胞大小的比較及分析

本研究發現似鲇高原鰍外周血中的成熟的嗜中性粒細胞體積明顯比組織中的小，類似現象在日本黃姑魚[12]的嗜中性粒細胞，長鰭裸頰鯛[8]的血栓細胞上也有所體現。一般認為血細胞在造血器官或組織中產生，發育成熟或接近成熟時才釋放到血液中。而同一類成熟的血細胞造血組織和外周血中的體積出現差異，本作者猜測可能與其具體的成熟程度相關，然而魚類血細胞發育詳細階段的研究仍然未見。

本研究還對似鲇高原鰍的雌雄個體間血細胞形態及血液指標做了比較，沒有差異故沒有列出。最近對斗魚(Bettasplendens)雌雄血細胞的研究也發現，不同性別魚的血細胞形態及血液指標差異不顯著[23]，在齊口裂腹魚[19]、長薄鰍(Leptobotiaelongata)[24]等魚中也存在這樣的現象。

3.5似鲇高原鰍與部分魚類外周血細胞化學染色的比較及分析

通過對似鲇高原鰍、貝氏高原鰍(T.bleekeri)[25]、長薄鰍[24]、黃石爬鮡(Euchiloglaniskishinouyei)[26]和齊口裂腹魚[19]血細胞的化學染色情況對比分析。在似鲇高原鰍外周血中，所有種類的白細胞PAS染色均呈陽性，即均含糖類物質。這與同屬于冷水魚類的黃石爬鮡[26]的報道一致。隨著細胞發育程度的加深，胞體顏色也逐漸加深，體現了似鲇高原鰍體內糖原的累積過程。通過SBB染色顯示，除粒細胞、單核細胞和淋巴細胞呈陽性，其余細胞均為陰性。與同屬冷水性魚類的黃石爬鮡和齊口裂腹魚都有相似之處，但與同屬鰍科的貝氏高原鰍、長薄鰍不同。由此可以得出不同魚類血細胞內脂質的有無與其生活的環境有密切關系。

圖版Ⅱ 似鲇高原鰍組織中血細胞Plate Ⅱ Blood cells in tissues of T.siluroides

1.PEB.原紅細胞；2.BEB.早幼紅細胞；3.POE.中幼紅細胞；4.OEB.晚幼紅細胞；5.E.紅細胞；6.E.衰老的紅細胞；7.E.溶解的紅細胞；8.DE.分裂的紅細胞；9.GB.原粒細胞；10.YPG.早幼粒細胞；11.NPG.嗜中性中幼粒細胞；12.NMG.嗜中性晚幼粒細胞；13.NG.嗜中性粒細胞；14.BPG.嗜堿性中幼粒細胞；15.BMG.嗜堿性晚幼粒細胞；16.BG.嗜堿性粒細胞；17.EPG.嗜酸性中幼粒細胞；18.EMG.嗜酸性晚幼粒細胞；19.EG.嗜酸性粒細胞；20.MB.原單核細胞；21.PM.幼單核細胞；22.M.單核細胞；23.LB.原淋巴細胞；24.PL.幼淋巴細胞；25.L.淋巴細胞；26.TH.血栓細胞；27，28.A.B.未知細胞；標尺 = 10 μm

圖版Ⅲ 似鲇高原鰍外周血和組織的 PAS 及 SBB 染色Plate Ⅲ Peripheral blood and tissue of blood cells imprint as revealed by PAS and SBB staining in T.siluroides1～13.PAS 染色；14～22.SBB 染色.1～5；15～17外周血涂片；6～14；18～22組織印片1,8，14,20.G.粒細胞；2,11，15,21.M.單核細胞；3,12，16，22.L.淋巴細胞；4,13.TH.血栓細胞；5,17.YPG.早幼粒細胞；6，18，PG.中幼粒細胞；7,19.MG.晚幼粒細胞；9.MB.原單核細胞；10.PM.幼單核細胞；標尺=10 μm

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