鯉皰疹病毒3型T分離株主要免疫原性蛋白的鑒定

鄭樹城，王 慶，李瑩瑩，王英英，曾偉偉，任 燕，石存斌

(1.中國水產科學研究院珠江水產研究所，農業部漁藥創制重點實驗室，廣東省水產動物免疫技術重點實驗室，廣州 510380；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306)

鯉皰疹病毒3型，又稱為錦鯉皰疹病毒(Koi herpesvirus，KHV)，是引起鯉(CyprinuscarpioLinnaeus )、錦鯉及其變種錦鯉皰疹病毒病(Koi herpesvirus disease，KHVD)的病原，死亡率高達80%以上，對全世界多個國家地區的鯉魚及錦鯉養殖產業造成了巨大的經濟損失[1]。CyHV-3隸屬于皰疹病毒目異皰疹病毒科鯉皰疹病毒屬，是具有囊膜的雙鏈DNA病毒[2]，病毒顆粒直徑為167～200 nm，基因組全長295 kbp，共編碼164個開放閱讀框(Open reading frame,ORF)，是已知基因組最大的皰疹病毒[3-5]。生物質譜技術鑒定結果表明，CyHV-3含有46個結構蛋白，包括16個囊膜蛋白、3個衣殼蛋白、2個皮層蛋白和25個未知蛋白[6-7]。

雖然質譜鑒定發現CyHV-3可能含有46個蛋白，但對于CyHV-3的免疫原性蛋白的研究卻非常有限。其中，ORF81編碼的囊膜蛋白是研究較早也是被多數學者廣泛認可的主要免疫原性蛋白之一[8]，以ORF81為靶基因設計的DNA疫苗在試驗中顯示具有較高的免疫保護率[9]。Fuchs等[10]對部分潛在的CyHV-3結構蛋白進行了研究，結果顯示囊膜蛋白ORF25、ORF65、ORF148和ORF149具有良好的免疫原性，Zhou等[11]設計的ORF25 DNA疫苗在魚體試驗上也證明了其具有良好的免疫保護效果。最近，Monaghan等[12]利用CyHV-3核衣殼制備的單克隆抗體和質譜基質輔助激光解析離子化-飛行時間質譜(Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight，MALDI-TOF/TOF)鑒定到一個具有良好免疫原性的新蛋白ORF84。另外，有研究表明非結構蛋白ORF12可能也具有免疫原性[13]。

本試驗采用20%～66%蔗糖密度梯度超速離心方法對CyHV-3病毒懸液進行純化，經SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色后進行Western blotting分析，結合質譜技術篩選免疫原性蛋白，為CyHV-3血清學診斷方法的建立、亞單位疫苗或DNA疫苗的研制提供更多候選抗原。

1 材料與方法

1.1 材料

鯉魚CCB細胞系[14]和鯉皰疹病毒3型T分離株由德國動物健康研究院(FLI)病原學研究所Sven.M Bergmann教授贈送；抗CyHV-3血清采自感染CyHV-3的病魚；鼠源抗錦鯉IgM單克隆抗體由本實驗室制備。

蔗糖Sucrose購自Sigma公司；SDS-PAGE預制膠、蛋白Marker、凝膠電泳緩沖液和轉膜緩沖液購自Thermo Scientific公司；HRP標記的山羊抗鼠IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒(PA110)購自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖與純化

細胞培養、病毒感染和增殖參考文獻[15]描述的方法。將出現明顯細胞病變的細胞進行凍融處理，于10 ℃下5 000 r/min離心30 min，收集上清液于10 ℃下32 000 r/min離心1.5 h，棄上清，用TNE緩沖液重懸沉淀；將病毒懸液加入由質量體積比分別為20%、40%、50%和66%的蔗糖密度梯度離心管上層，于10 ℃下25 000 r/min離心1 h；收集每一層的病毒樣品，加入TN緩沖液后于10 ℃下25 000 r/min離心30 min，收集沉淀，用TN緩沖液重懸，將純化的病毒顆粒吸附于碳膜鎳網上，3%的磷鎢酸(pH7.2～7.4)負染1 min后在透射電子顯微鏡下觀察。

1.2.2 SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色

聚丙烯酰胺凝膠由12%的分離膠和4%的濃縮膠組成，將純化的病毒與5×蛋白上樣緩沖液按比例混合后在沸水中水浴10 min，冷卻后點樣進行電泳。電泳結束后，其中一塊凝膠用考馬斯亮藍染色和脫色，并用凝膠成像系統掃描。

1.2.3 Western blotting

將上述SDS-PAGE分離后的另一塊凝膠用濕轉的方法轉移至硝酸纖維素(NC)膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉3 h，然后用含有0.05%吐溫的PBS (PBST )清洗3次，每次10 min；用1∶200稀釋的錦鯉抗CyHV-3的陽性血清4 ℃下孵育過夜，然后用0.05%的PBST清洗3次，每次10 min；加入1∶1 000稀釋的鼠抗錦鯉IgM單抗室溫孵育1.5 h，接著用0.05%的PBST清洗3次，每次10 min；最后加入1∶5 000稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG室溫孵育1 h，用0.05%的PBST清洗3次后進行DAB顯色。

1.2.4 質譜分析

仔細比對考馬斯亮藍脫色凝膠和DAB顯色的NC膜，將與NC膜顯色明顯條帶相應位置的考馬斯亮藍脫色凝膠切出，進行膠內酶解，運用液相色譜串聯質譜(Liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)進行分析，質譜原始數據用MASCOT在uniprot數據庫中檢索。

2 結果

2.1 病毒純化

病毒純化后在電鏡下觀察到許多典型的呈圓形狀完整囊膜包裹或只有裸露核衣殼的CyHV-3病毒顆粒，顆粒直徑為150～200 nm(圖1)，與之前的報道一致。

圖1 透射電鏡下純化的CyHV-3顆粒Fig.1 Purified particles of CyHV-3 under transmission electron microscope(a)黑色細箭頭為完整的CyHV-3病毒顆粒，黑色粗箭頭為囊膜破損的CyHV-3病毒顆粒，白色細箭頭為裸露的核衣殼；(b)圖(a)中方框放大部分，圖中標尺為200 nm.

2.2 SDS-PAGE和Western blotting結果

將純化的病毒進行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍染色和脫色后可見到許多豐度不一的蛋白條帶[圖2(a)]。以抗CyHV-3錦鯉陽性血清作為一抗進行Western blotting，結果顯示多條蛋白可以被陽性血清識別，具有特異性免疫反應[圖2(b)]。

2.3 質譜分析

剪切其中4條具有明顯特異性免疫反應的蛋白膠條進行LC-MS/MS分析，4個蛋白鑒定結果分別為ORF92、ORF66、ORF72和ORF81[圖2(b)和表1]。

圖2 純化的CyHV-3病毒SDS-PAGE電泳結果(a)和Western blotting結果(b)Fig.2 Results of SDS-PAGE of purified CyHV-3 virions (a) and Western blotting analysis (b)1:純化的CyHV-3病毒顆粒，M:蛋白標準.

表1 CyHV-3主要免疫原性蛋白LC-MS/MS鑒定Tab.1 Identification of major immunogenic proteins from CyHV-3 by LC-MS/MS

3 討論

錦鯉皰疹病毒病自從上世紀90年代在歐洲暴發以來，已傳播至世界多個國家地區[16-17]，最近的文獻報道顯示，該病已波及越南和伊朗等國家[18-19]。我國是2002年在深圳進口的錦鯉中首次檢測到[20]，之后在廣州、海南和東北等地區均有KHVD暴發的報道[21-22]。遺憾的是，目前仍沒有針對KHVD的有效疫苗，雖然之前的研究表明CyHV-3減毒疫苗和改良的活疫苗在魚體試驗中顯示具有顯著的保護作用[23-25]，但減毒疫苗存在毒力返強和潛伏感染的風險，安全隱患不可忽視。

相較傳統的疫苗，基因工程疫苗如DNA疫苗和亞單位疫苗，因具有易制備、穩定和高效等優點，已成為許多水生動物疾病疫苗的重要研究方向。其中，部分DNA疫苗和亞單位疫苗由于具有良好的免疫保護效果，已正式投入市場使用，進入漁用疫苗商業化，如加拿大分別于2002年和2005年批準生產的傳染性胰腺壞死病毒亞單位疫苗和傳染性造血器官壞死病毒DNA疫苗[26]。因此，在研制傳統的減毒疫苗或滅活疫苗的同時，基因工程疫苗的研制無疑為水生動物疾病的防控策略提供了更多選擇。而選擇具有良好免疫原性的蛋白是研制這類疫苗的重要基礎，因此，本研究基于蛋白質組學和免疫學的方法鑒定了幾個CyHV-3免疫原性蛋白，為KHVD基因工程疫苗的研制提供了重要的候選抗原。

基于蛋白質組學和免疫學的交叉學科稱為免疫蛋白質組學(Immunoproteomics)，它結合了蛋白質組學高通量的優勢和免疫學的技術方法，在病毒和細菌等病原微生物的免疫原性蛋白研究中廣泛應用，有力地推動了該研究領域的發展。Jang等[27]分別將自然感染淋巴囊腫病毒(Lymphocystis disease virus，LCDV)和LCDV滅活疫苗免疫的褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)抗血清通過一維凝膠電泳、免疫印跡分析和質譜分析的方法對褐牙鲆抗原性蛋白進行篩選，結果顯示LCDV滅活疫苗免疫后的褐牙鲆能產生識別LCDV主要衣殼蛋白的抗體，表明LCDV主要衣殼蛋白具有良好的免疫原性，可作為疫苗制備的候選抗原。Shin等[28]也通過同樣的技術方法對感染褐牙鲆的海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)免疫原性蛋白進行了篩選。免疫蛋白質組學的應用為病原微生物免疫原性蛋白的篩選提供了便利的工具，也為相關疾病疫苗的研制奠定了基礎。

本次質譜鑒定的4個蛋白中，有3個是衣殼蛋白(ORF66、ORF72和ORF92)，其中ORF66和ORF72為首次鑒定的具有免疫原性的衣殼蛋白。之前的研究發現CyHV-3免疫原性蛋白多數為囊膜蛋白[8,10,11]，但本研究的結果表明衣殼蛋白可能是激發宿主產生抗體的主要抗原，囊膜病毒入侵宿主后需要通過病毒囊膜與宿主細胞膜發生膜融合進入細胞質，因此病毒核衣殼可能在進入細胞質的過程中激發了宿主產生體液免疫應答，但具體的分子作用機制有待進一步研究。另外，也有文獻報道用本文類似的方法只鑒定到一個免疫原性蛋白ORF12，該蛋白為腫瘤壞死因子受體的同源蛋白[13]。但ORF12是否真正具有免疫原性，作者并未對其進行后續鑒定。本研究只對其中幾條明顯特異性免疫反應的蛋白條帶進行了質譜分析，未對所有特異性免疫反應的蛋白進行進一步鑒定。因此，關于CyHV-3的免疫原性蛋白仍需要更多方法來確定。

本研究采用錦鯉抗CyHV-3陽性血清作為一抗對純化CyHV-3病毒顆粒進行免疫印跡分析，對其中4條具有明顯特異性免疫反應的蛋白膠條進行LC-MS/MS鑒定，結果表明ORF92、ORF66、ORF72和ORF81為免疫原性蛋白，可作為血清學診斷方法的建立和亞單位疫苗、DNA疫苗研制的候選抗原。

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