藏藥寬筋藤HPLC指紋圖譜研究※

● 朱小芳 謝一輝 馬亞娟 白文婷 平欲暉 黃麗萍

寬筋藤為防已科植物中華青牛膽Tinosporasinensis(Lour.)Merr.的干燥莖藤，藏藥名為勒哲，又名大接筋藤、松根藤、舒筋藤、牛掙藤、大松身，廣泛分布于廣西、廣東、西藏、云南、海南等地區[1-2]，其味微苦，性寒，歸肝經，主要有舒筋通絡，祛風止痛之功能，用于腰肌勞損，風濕痹痛，跌打損傷等[3]。該屬植物的塊根、藤莖常作為中藥入藥。近年來，在藏藥質量管理中出現的多種問題，如基原不統一或不清楚[4]，藥用部位不清楚，藥名混亂，同名異源或應用混亂[5]等。目前藏藥寬筋藤在質量控制上還沒有一種系統性的監測方法，為此本文試圖建立其HPLC指紋圖譜，為產品的質量控制奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1儀器旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent有限公司)，Sartoris BS214-D型電子天平(德國賽托利斯儀器有限公司)，Milli-Q超純水儀(江西鼎技科學儀器有限公司)，B-260恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)，SHZ-III循環水真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)，KQ-50E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，AE-240型十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒公司)，FZ102微型植物粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.2試劑甲醇，乙腈，甲酸均為色譜級(美國ACS公司)，水為Milli-Q超純水儀制備，其他試劑均為分析純。

1.3試藥丁香苷、Tinoscorside D、3，4-二甲氧基苯基-O-β-D-呋喃芹糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品，為本實驗室分離得到，通過碳氫譜和質譜數據等確定它們的結構，純度經HPLC面積歸一化法檢測大于98%。

1.4樣品本實驗藥材由西藏醫學院格桑次仁副教授采購，共8批寬筋藤樣品，經西藏醫學院格桑B次仁副教授鑒定為防己科植物青牛膽屬中華青牛膽Tinosporasinensis(Lour.)Merr.的藤莖。見表1。

表1 藥材來源

續表1

樣品采集地點采集時間S6藏醫學院藏藥廠2016.04S7西藏2015.05S8新疆烏魯木齊2016.08

2 方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：Spursil C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫(0-15min3%A;15-40min，3%-13%A;40-60min，13%-13%A;60-68min，13%-18%A;68-83min，18%-18%A;83-90min，18%-20%)，檢測波長為272nm，柱溫25℃，流速為1ml/min，進樣量為10μL。

2.2對照品溶液的制備取丁香苷、Tinoscorside D、3，4-dimethoxyphenyl-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside的對照品約2.0mg，精密稱定，置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解定容。即得對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備取寬筋藤粉末2.0g(過二號篩)，精密稱定，加入60%甲醇20ml，回流提取3次，每次20min，合并濾液，回收試劑濃縮至干，用甲醇溶液超聲溶解并定容至10ml，過0.22μm膜，即得到供試品溶液。

2.4方法學考察為了分析方法的可行性，以西藏拉薩市場采集的寬筋藤藥材為研究對象，對其精密度，穩定性和實驗方法的重復性進行相應考察，選擇保留時間為40.7min左右的色譜峰為參照峰，計算HPLC色譜圖中色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。

2.4.1 精密度試驗 取寬筋藤藥材，按2.3方法制備同一供試品溶液，按2.1色譜條件連續進樣6次，考察儀器的精密度，測得相對峰面積和相對保留時間。結果顯示，相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，所用儀器的精密度良好。結果見表2和表3。

表2 相對保留時間精密度實驗

表3 相對峰面積精密度實驗

2.4.2 穩定性試驗 取寬筋藤藥材，按2.3法制備同一供試品溶液，依照2.1色譜條件，分別在0h，2h，4h，8h，16h，24h測定，記錄色譜圖，測得相對保留時間和相對峰面積。結果顯示(見表4和表5)相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，供試品溶液在24h內穩定。

表4 相對保留時間穩定性實驗

表5 相對峰面積穩定性實驗

2.4.3 重復性試驗 取寬筋藤藥材2.0g，精密稱定，共6份，按2.3法制備同一供試品溶液，按2.1色譜條件進樣分析。結果顯示(見表6和表7)，樣品制備方法重復性好，符合指紋圖譜的要求測得相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%。

表6 相對保留時間重復性實驗

表7 相對峰面積重復性實驗

2.5藏藥寬筋藤藥材指紋圖譜分析

2.5.1 藏藥寬筋藤藥材指紋圖譜的采集 取不同產地，不同采收時間的寬筋藤藥材，按2.3法制備供試品溶液，按2.1色譜條件進樣分析。根據色譜圖，并對其色譜圖進行積分，同時標定14個共有峰。所選擇的共有峰可以較全面的體現出寬筋藤中極性部位化學成分的信息。通過安捷倫化學工作站輸出不同產地藥材的HPLC色譜圖。

2.5.2 藏藥寬筋藤藥材的指紋圖譜相似度分析 根據國家藥典委員會制定的《中國色譜指紋圖譜相似度評估系統》(2010版)對不同產地，不同采收時間的寬筋藤藥材指紋圖譜數據進行分析，寬筋藤藥材指紋圖譜的相關參數進行了自動匹配，標定了14個共有峰，同時給出了對照指紋圖譜圖1，將各樣品和對照指紋圖譜進行比較，計算各產地寬筋藤藥材提取物指紋圖譜的相似度。不同產地指紋圖譜見圖2，指紋圖譜相似度結果見表8。

圖1 寬筋藤對照指紋圖譜

圖2 不同產地寬筋藤高效液相指紋圖譜

S1S2S3S4S5S6S7S8對照指紋圖譜S110.860.7810.750.8790.880.8510.8140.896S20.8610.9530.8070.9130.9540.9570.9170.98S30.7810.95310.6270.8020.9630.9740.8250.905S40.750.8070.62710.8870.6720.6610.9260.885S50.8790.9130.8020.88710.8490.8520.9140.957S60.880.9540.9630.6720.84910.9760.8410.932S70.8510.9570.9740.6610.8520.97610.8370.929S80.8140.9170.8250.9260.9140.8410.83710.965對照指紋圖譜0.8960.980.9050.8850.9570.9320.9290.9651

2.5.3 指紋圖譜中色譜峰的化學指認 用化學結構已被鑒定的部分化合物做對照，對照指紋圖譜中部分共有指紋峰進行確認，通過保留時間和圖譜，確認8號峰為3，4-二甲氧基苯基-O-β-D-呋喃芹糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，9號峰為丁香苷，10號峰為Tinoscorside D。

3 討論

本實驗對提取溶劑種類與方式、體積分數、料液比、時間均進行了考察，對比了甲醇、乙醇，超聲、回流兩種方式所得供試品溶液的指紋圖譜，結果表明：甲醇回流>乙醇回流>甲醇超聲>乙醇超聲，故選擇甲醇回流法進行提取。比較了體積分數40%，60%，80%，100%甲醇所提取的供試品溶液圖譜，結果表明甲醇濃度為40%和100%濃度提取出的色譜峰少，而且峰面積偏低；甲醇濃度為60%和80%時，色譜峰數量以及峰面積相差不大，故從色譜峰數量，峰面積以及溶劑成本多方面考慮，選擇60%甲醇溶液為提取溶劑。分別考察了料液比為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25后的供試品溶液圖譜，發現不同的料液比對于寬筋藤提取液的影響甚小，從節約成本等方面考慮，本實驗的料液比選擇1∶10。分別考察了回流提取20min，40min，60min后的供試品溶液圖譜，結果表明：從峰數量上看，不同提取時間所得到峰數量幾乎相同；從峰面積和峰型上看，提取20min最佳。故本實驗選擇提取時間為20min。

用乙腈-0.1%甲酸水為流動相進行洗脫條件的考察，反復調整流動相比例后，確定洗脫比例，采用DAD檢測器在190-400nm處進行紫外吸收全波段掃描，并獲取不同波長下的數據(210，254，272nm，280，323，365nm)，對于指紋圖譜的確認必須遵循信息量最大化的原則，結果顯示，272nm下色譜峰的數量較多且分離度較好。故選擇272nm下作為指紋圖譜的檢測波長。

本實驗的結果表明8批寬筋藤藥材的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%。通過《中國色譜指紋圖譜相似度評估系統》(2010版)計算出8批藥材的相似度均大于0.8，符合指紋圖譜的分析要求。表明HPLC指紋圖譜方法可作為藏藥寬筋藤質量控制的檢測方法。一方面通過比較圖譜，可以直觀看出各共有峰的比例變化，來判斷產品質量的變；另一方面也可以通過測定各峰峰面積對活性指標成分進行定量。本實驗所建立的HPLC指紋圖譜可以有效分析和監測其質量。

[1]全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編[M].上冊.北京：人民衛生出版社，1978：652.

[2]廣東中藥志編輯委員會．廣東中藥志[M]．廣州：廣東科技出版社，1994：501-502．

[3]廣東省食品藥品監督管理局.廣東省中藥材標準(第一冊)[S].廣州：廣東科技出版社，2004：183.

[4]鐘國躍，周福成，石上梅，等.藏藥材常用品種及質量標準現狀調查分析研究[J].中國中藥雜志，2012，37(16)：2349-2355.

[5]國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草：藏藥卷[M].s上海：上海科學技術出版社，2002.