6種胃液游離microRNAs對胃腺癌的診斷價值

陳妍潔， 吳 昊， 董 玲， 劉韜韜， 沈錫中*

1. 復旦大學附屬中山醫院消化科，上海 200032 2. 復旦大學附屬中山醫院上海肝病研究所，上海 200032

胃癌在全球占腫瘤發病率的第4位，致死率也較高[1-2]。其中，近年來每年約75%的新發病例來自于亞洲[1-2]。目前，臨床上胃癌的無創診斷標志物如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)的靈敏性和特異性均不高，對胃癌早期診斷作用不明顯，而胃癌診斷的早晚決定患者的預后。因此，對于新型胃癌診斷標志物的探索顯得尤為重要。MicroRNAs(以下簡稱miRNAs)是一類保守的非編碼RNA分子，通常由18～24個核苷酸組成[3-4]。目前認為其在胃癌的發病中起至關重要的作用。多項研究[5-12]發現，一些miRNAs在胃癌組織和癌旁組織中的表達存在差異。有研究[13]發現，miR-17、miR-18a、miR-20a、miR-21、miR-106b、miR-378和miR-638在胃癌組織中表達異常，其中6個miRNAs(miR-17, miR-18a, miR-20a, miR-21, miR-106b、miR-378)在胃癌及癌旁組織中的表達存在差異。

目前，多項研究[14-16]發現，胃癌患者外周血及胃液中的癌癥相關miRNAs表達也發生了改變。由于胃液屬于胃癌腫瘤微環境的組成部分，因此胃液中miRNAs的表達與胃癌細胞的發生、發展聯系更加緊密，可反映胃癌細胞的旁分泌情況。因此，本研究選取上述6個胃癌相關miRNAs，分析其在胃癌患者胃液中的表達，并探討其作為胃癌診斷標志物的價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月至12月于復旦大學附屬中山醫院進行胃鏡檢查的53例患者，包括24例胃腺癌患者、16例胃潰瘍患者和13例慢性胃炎患者。胃腺癌患者入選標準：(1)病理確診為胃腺癌；(2)在胃鏡檢查前未接受化療或放療等腫瘤相關治療。胃潰瘍患者入選標準：(1)病理診斷排除惡性潰瘍；(2)藥物治療后潰瘍愈合。慢性胃炎患者入選標準：病理診斷包括慢性非萎縮性胃炎(伴或不伴腸化生)、慢性萎縮性胃炎(伴或不伴腸化生)。所有患者病灶無活動性出血，檢查前12 h禁食。本研究經醫院倫理委員會批準，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 樣品處理和miRNAs提取 胃液在活檢前取出，4℃下 3 000×g離心10 min，取上清分裝后保存在-80℃冰箱中。Cel-miR-39(廣州市銳博生物科技有限公司)作為外源性內參加入胃液中，濃度為1×10-2pmol/L。

胃液總miRNAs按照miRcute miRNAs Isolation Kit[天根生化科技(北京)有限公司]說明書提取，具體過程如下：200 μL胃液中加入等體積裂解液MZ，震蕩器震蕩混勻30 s；室溫放置5 min，使核酸蛋白復合物完全分離；室溫13 400×g，離心10 min，取上清，轉入1個新的無酶離心管中；加入200 μL氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15 s，室溫放置5 min；室溫13 400×g離心15 min，取上層無色水相層至新管中；緩慢加入1/3體積的無水乙醇并混勻，將混勻液體轉入吸附柱miRspin，室溫放置2 min，室溫13 400×g離心30 s，保留流出液；加入流出液體積2/3的無水乙醇并混勻，轉入吸附柱miRelute，室溫放置2 min，13 400×g離心30 s，離心后棄去流出液，保留吸附柱；向吸附柱miRelute中加入500 μL去蛋白液MRD，靜置2 min，室溫13 400×g離心30 s，棄廢液；向吸附柱miRelute中加入600 μL漂洗液RW，靜置2 min，室溫13 400×g離心30 s，棄廢液；向吸附柱miRelute中加入600 μL漂洗液RW，靜置2 min，室溫13 400×g離心30 s，棄廢液；將吸附柱miRelute放入2 mL收集管中，室溫13 400×g離心1 min，去除殘余液體；將吸附柱miRelute轉入1個新的離心管中，加入30 μL無酶DD水，室溫放置2 min，13 400×g離心2 min。得到的總miRNAs保存在-80℃冰箱中。

總miRNAs采用miRcute miRNAs First-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]反轉錄成cDNA：(1)在miRNAs的3′端加入Poly(A)尾；(2)將Poly(A)尾修飾過的miRNAs反轉錄成為cDNA。

1.3 qRT-PCR半定量miRNAs miRNAs的PCR反應采用miRcute miRNAs qPCR Detection Kit試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]。miRNAs的引物序列見表1。將每個樣品進行40個周期的循環反應：94℃變性20 s，60℃退火30 s，72℃擴增32 s。相對miRNAs計算公式為2-ΔCt[ΔCt = Ct (miRNAs) - Ct (內參)][17]。

表1 miRNAs的引物序列

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件進行分析。兩組間miRNAs的表達采用非參數檢驗Mann-Whitney。用ROC曲線下面積(AUC)對miRNAs的診斷效能進行評估。檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 患者基本信息 24例胃癌患者中，男性17例，女性7例；年齡38～86歲，平均(65.92±11.03)歲。13例慢性胃炎患者年齡為28～82歲，平均(65±8.01)歲；16例胃潰瘍患者年齡為34～80歲，平均(66±11.88)歲。由慢性胃炎和胃潰瘍患者組成的對照組中，男性21例，女性8例。胃癌組和對照組患者年齡和性別差異無統計學意義。24例胃癌患者CEA、CA199、CA724這3項腫瘤指標中至少有1項為陽性，其中19例患者CEA陽性、1例CA724陽性、1例CEA和CA199陽性、2例CEA和CA724陽性、1例3項指標均為陽性；對照組中有6例至少有1項腫瘤標志物為陽性，其中1例為CEA陽性，5例為CA724陽性。

2.2 兩組間6個胃液miRNAs的表達差異 結果(圖1)顯示：胃癌患者胃液中miR-17、miR-18a、miR-20a、miR-21和miR-378較對照組上調(P<0.05；兩組胃液miR-106b差異無統計學意義。

2.3 ROC曲線分析miRNAs診斷效能 結果(圖2、表 2)顯示：miR-17、miR-18a、miR-21和miR-378診斷胃癌的效能中等；miR-20a和miR-106b診斷胃癌的效能較低。

圖1 胃癌相關miRNAs在胃液中的表達

圖2 胃癌相關miRNAs的診斷效能

miRNAAUC95%CI上限95%CI下限敏感性特異性miR-170.7100.5700.8500.5830.793miR-18a0.7390.6060.8710.4580.931miR-20a0.6840.5410.8270.7920.552miR-210.7170.5780.8560.4580.966miR-106b0.6410.4920.7900.8750.414miR-3780.7210.5850.8580.7500.586

3 討 論

大量研究[14-16]發現，組織和血液中的miRNAs可作為胃癌的診斷和預測標志物。但是，對于胃液中miRNAs的研究目前還較少。胃液作為直接接觸胃癌組織的體液，屬于胃癌的腫瘤微環境組成之一，可直接反映腫瘤的發生、發展、侵襲、遷移，且臨床上較易獲得。因此，胃液中所含的小分子物質有較高的診斷特異性，可成為胃癌早期的診斷標志物。另外，也有研究[18-19]顯示，不同的溫度、時間、pH值、酶消化及凍融循環都難以改變體液中miRNAs的含量，提示體液中miRNAs具有相對穩定和抗降解的特性。雖然，目前尚未證明miRNAs在胃液中也具有同樣的穩定性，但是我們在實驗過程中發現，離心取上清后采用-80℃的保存方式并不影響后續的qRT-PCR實驗，且miRNAs的相對表達量較為恒定，提示胃液中的miRNAs也有較好的穩定性，可能成為未來胃癌無創診斷的標志物之一。

本研究選取了系統綜述胃癌組織中表達有明顯差異的6個miRNAs在胃液中進行驗證[13]，并探討其對胃癌的診斷價值。本研究發現，這6個miRNAs在胃癌患者的胃液中表達均有升高，其中，miR-17、miR-18a、miR-21和miR-378在癌和癌旁組織中的表達差異有統計學意義(P<0.05)，且具有中等診斷效能。這些結果初步表明，胃液中的miRNAs可作為胃癌早期診斷的標志物。但是，本研究進行Logistic回歸時未能將6個miRNAs整合。

胃癌患者胃液中miRNAs變化趨勢與胃癌組織中miRNAs的表達不完全一致。文獻[13]報道，miR-378在胃癌組織中表達較正常癌旁組織有所降低，而本研究結果相反。有研究[20]認為，一方面，胃癌細胞在生長過程中伴隨大量壞死，壞死細胞被動釋放大量的miRNAs于胃液中；另一方面，腫瘤細胞會主動釋放含有miRNAs的微囊泡至胃液中，以精細調控腫瘤微環境，并向遠處的細胞傳遞細胞信號，促進腫瘤的發生、發展和轉移。但這些理論還有待進一步研究。

將胃液miRNAs作為胃癌診斷標志物的優勢在于：首先，胃液由胃黏膜直接分泌，相比于血清或者血漿中的miRNAs，受全身其他疾病的影響較小，因此對于胃癌的診斷更具特異性；其次，胃液可通過胃鏡和胃管獲得，適用于長期服用抗凝藥物不能活檢、早期胃癌胃鏡下難以識別以及無法行胃鏡檢查的患者；再次，目前miRNAs的提取和檢測手段越來越成熟。

然而，胃液中miRNAs的檢測也面臨許多挑戰。首先，試驗前飲水、唾液分泌、病灶活動性出血等使胃液的質控較難，進而改變胃液中miRNAs的表達；其次，胃液中miRNAs對胃酸環境的穩定性要求及其儲存條件尚未標準化；再次，幽門螺桿菌的感染是否影響胃液中miRNAs的表達水平目前尚不明確。

綜上所述，本研究發現，胃液中的miRNAs可作為早期胃癌的診斷標志物。雖然本研究的樣本量較少，但采用了系統綜述的結果，選取胃癌患者表達陽性率最高的6個miRNAs，且對照組同時納入了胃潰瘍和慢性胃炎的患者，結果的準確性較高。另外，實驗對于胃液的儲存和處理都嚴格質控，及時處理，減少不同胃液質量所造成的偏差，可保證結果的可靠性。在后續實驗中，將擴大樣本量，并在對照中加入其他胃癌癌前病變(如中高級別上皮內瘤變)或間質瘤、平滑肌瘤等病變，以期提高胃液miRNAs作為胃癌診斷指標的特異性，并進一步研究胃液中miRNAs的改變與腫瘤分化、侵襲、轉移的相關性及其調控機制。

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