木香烴內酯誘導卵巢癌細胞凋亡機制研究

石小燕，劉 嶸

(1. 湖北職業技術學院醫學分院,湖北 孝感 432000；2. 華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院，湖北 武漢 430030)

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，嚴重威脅女性的健康，其發病率在女性生殖系統腫瘤中占第3位，但是卵巢癌患者病死率居婦科惡性腫瘤之首[1]。目前卵巢癌主要治療方法是化療，常用的化療藥物有順鉑、阿霉素、環磷酰胺、長春新堿和放線菌素D等。然而化療藥物具有較大的毒副作用且較易產生耐藥性，導致化療的臨床療效并不是很理想。因此，尋找新的能夠殺傷卵巢癌細胞的化合物和天然產物具有十分重要的意義。藥用植物用來治療腫瘤已有幾千年的歷史，據統計世界上已有3 000多種植物用于腫瘤的治療[2]。木香烴內酯是一類來源于多種草藥的倍半萜內酯類化合物，其具有消炎、抗氧化、抗血管新生以及抗腫瘤等特性，但對卵巢癌細胞系的作用及對卵巢癌中NF-κB信號通路的影響并不清楚。本研究以卵巢癌細胞系Skov3為研究對象，觀察了木香烴內酯對Skov3細胞增殖、凋亡及NF-κB信號通路的影響，現將結果報道如下。

1 實驗資料

1.1藥物、試劑與儀器 木香烴內酯由南開大學提供，純度>98%，用DMSO配制成20 mmol/L儲備液，分裝保存入-20 ℃備用。RPMI1640培養基、胰酶和胎牛血清購自Gibco公司，MTT和DMSO購自sigma公司。流式細胞儀為美國BD公司，Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司。NF-κB p65、Caspase-3、Caspase-9和β-actin蛋白抗體購自CST公司，化學發光顯色試劑購自Thermo公司。

1.2細胞株 人卵巢癌細胞系Skov3由天津醫科大學總醫院提供。

1.3實驗方法

1.3.1木香烴內酯對卵巢癌細胞系Skov3生長影響實驗 采用MTT法檢測。取對數生長期的Skov3細胞，細胞計數后調整細胞濃度至5×104mL-1，將細胞鋪入96孔板中，每孔200 μL，使每孔最終細胞數為1×104/孔。將96孔板放入細胞培養箱中12 h使細胞貼壁。取保存于-20 ℃的木香烴內酯化合物，按照濃度梯度稀釋，按照一定的體積加入終濃度為0.25，0.5，1，2.5，5，10, 20 μmol/L的木香烴內酯。木香烴內酯作用72 h后，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，放入培養箱中孵育4 h。孵育結束后，2 000 r/min離心15 min，棄上清。沉淀用200 μL DMSO重懸，充分溶解后檢測OD 570 nm吸光值。

1.3.2木香烴內酯對卵巢癌細胞系Skov3凋亡影響實驗 取對數生長期的Skov3細胞，用胰酶消化后進行細胞計數，并調整細胞濃度5×104mL-1，將細胞鋪入6孔板中，每孔最終細胞數為5×104，體積為1 mL。將6孔板放入細胞培養箱中孵育12 h使細胞完全貼壁。按照一定體積加入木香烴內酯使總濃度分別為0.5，1，2.5，5 μmol/L。同時設置對照孔，每個濃度設置3個復孔。放入37 ℃細胞培養箱中培養24 h。24 h后，將細胞收集于流式管中，1 200 r/min離心7 min后棄上清。沉淀用100 μL 1×binding buffer重懸，每管分別標記5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育15 min后，每管補加200 μL 1×binding buffer，于1 h內流式檢測細胞凋亡率，注意設置單陽管。根據細胞凋亡時細胞所表現出來的特征把細胞分為3類，Annexin V+/PI+為中晚期凋亡細胞，Annexin V+/PI-為早期凋亡細胞，Annexin V-/PI-為活細胞，早期細胞凋亡率和中晚期細胞凋亡率合計為細胞凋亡率。

1.3.3木香烴內酯對卵巢癌細胞系Skov3中NF-κB p65基因表達影響實驗 取對數生長期的Skov3細胞，調節細胞濃度為5×104mL-1，按照1 mL/孔接種于6孔板中。37 ℃孵箱中培養12 h使細胞完全貼壁后加入終濃度為1，2.5，5 μmol/L的木香烴內酯處理，24 h后收集細胞。將細胞用Trizol裂解，Trizol法提取細胞內部RNA，采用RT-PCR法檢測NF-κB p65基因表達情況。以GAPDH為內參照，以DMSO為對照，計算ΔΔCt值。

1.3.4木香烴內酯對卵巢癌細胞系Skov3中NF-κB及凋亡相關蛋白表達影響實驗 采用Western Blot法檢測。取對數生長期的Skov3細胞，調節細胞濃度為5×104mL-1，按照1 mL/孔接種于6孔板中。37 ℃孵箱中培養12 h使細胞完全貼壁后加入終濃度為1，2.5，5 μmol/L的木香烴內酯處理，24 h后收集細胞。將細胞用200 μL RIPA重懸，冰上裂解30 min(每10 min震蕩混勻1次)，然后12 000 r/min 4 ℃離心15 min，吸取蛋白上清。在蛋白上清中加入5×載樣緩沖液，100 ℃煮樣5 min使蛋白充分變性。配制12%的蛋白膠進行SDS-PAGE電泳，上層濃縮膠電壓為60 V，下層分離膠為110 V。電泳完成后將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶室溫封閉1 h后，孵育NF-κB p65、Caspase-3和Caspase-9一抗過夜，洗去未結合的一抗后孵育一定比例稀釋的二抗，然后進行化學發光顯色。

1.4統計學方法 數據采用GraphPad Prism 5軟件進行處理分析，組間比較采用配對t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1木香烴內酯對卵巢癌細胞系Skov3生長影響0 μmol/L木香烴內酯對細胞生長抑制率為(0.30±1.60)%，0.25 μmol/L為(2.28±1.13)%，0.5 μmol/L為(10.37±1.48)%，1 μmol/L為(30.04±1.40)%，2.5 μmol/L為(35.04±2.37)%，5 μmol/L為(46.34±3.06)%，10 μmol/L為(67.03±2.42)%,20 μmol/L為(73.25±4.26)%，50 μmol/L為(84.47±2.54)%。在0～50 μmol/L濃度范圍內木香烴內酯對Skov3細胞的生長抑制作用具有明顯的濃度依賴性，木香烴內酯對Skov3細胞的IC50為5.11 μmol/L。

2.2木香烴內酯對卵巢癌細胞系Skov3凋亡影響經過不同濃度木香烴內酯處理Skov3細胞24 h后，細胞開始出現明顯凋亡。隨著木香烴內酯濃度的增加，凋亡細胞的比例明顯增加，其中木香烴內酯0 μmol/L時細胞凋亡率為(7.40±2.90)%，2.5 μmol/L時為(11.84±0.95)%，5 μmol/L時為(21.89±1.93)%，10 μmol/L時為(57.6±3.39)%，20 μmol/L時為(84.1±0.78)%，各濃度間比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見圖1及表1。

2.3木香烴內酯對人卵巢癌細胞系Skov3中NF-κB基因表達影響 不同濃度木香烴內酯處理24 h后，NF-κB基因表達量濃度依賴性的下調，各濃度間比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見圖2。

圖1 不同濃度木香烴內酯誘導卵巢癌細胞系Skov3凋亡代表性散點圖

表1 不同濃度木香烴內酯誘導人卵巢癌細胞系Skov3凋亡情況

圖2 不同濃度木香烴內酯組NF-κB p65基因表達情況

2.4木香烴內酯對卵巢癌細胞系Skov3中NF-κB蛋白以及凋亡相關蛋白影響 不同濃度木香烴內酯處理24 h后，5 μmol/L和10 μmol/L木香烴內酯組細胞內NF-κB p65和Caspase-3蛋白濃度均明顯低于2.5μmol/L木香烴內酯組(P均<0.05)，5μmol/L和10 μmol/L 木香烴內酯組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；10 μmol/L木香烴內酯組Caspase-9蛋白濃度明顯低于2.5 μmol/L和5 μmol/L木香烴內酯組(P均<0.05)，2.5 μmol/L和5 μmol/L木香烴內酯組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3及表2。

3 討 論

圖3 不同濃度木香烴內酯組卵巢癌細胞系Skov3中NF-κB蛋白及凋亡相關蛋白表達情況

表2 不同濃度木香烴內酯組卵巢癌細胞系Skov3中NF-κB蛋白及凋亡相關蛋白水平比較

注：①與2.5 μmol/L木香烴內酯組比較，P<0.05。

木香烴內酯主要來源于風毛菊屬和月桂屬植物的根部，對白血病、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌以及膀胱癌等多種類型的腫瘤細胞具有明顯的殺傷作用[3]，其在抗腫瘤中的主要作用有誘導細胞周期阻滯、細胞凋亡、抑制Wnt/β-Catenin信號通路、端粒酶活性抑制、抑制腫瘤侵襲和遷移等[4-7]。本研究結果顯示，木香烴內酯對人卵巢癌細胞系生長有明顯抑制作用，且隨著木香烴內酯濃度的提高，細胞凋亡率明顯升高，說明木香烴內酯主要是通過誘導細胞凋亡來實現其抗腫瘤作用的。而誘導細胞凋亡的機制有很多，Yang等[8]發現木香烴內酯能夠通過誘導細胞內部ROS的積累從而誘導細胞凋亡。Butturini等[9]在急性髓系白血病中的研究發現木香烴內酯能夠抑制STAT3的磷酸化以及其與DNA的結合。

NF-κB是細胞核內重要的轉錄因子，參與多種基因的表達和調控。NF-κB蛋白家族包括p50/p105、p52/p100、RelA/p65和C-Rel，其中RelA/p65 是NF-κB家族常見的重要轉錄因子，在腫瘤發生、發展以及惡化過程中起重要作用，且參與多種腫瘤相關基因的轉錄調控，因此NF-κB可以作為腫瘤治療的重要靶點[10]。目前報道的靶向NF-κB從而發揮抗腫瘤作用的化合物主要包括小白菊內酯、含笑內酯以及Da0324等[11-13]。Lin等[14]研究表明抑制NF-κB能夠激活Caspase家族蛋白從而誘導細胞凋亡。本研究結果顯示，木香烴內酯能夠抑制卵巢癌細胞中的NF-κB基因和蛋白的表達并呈明顯的濃度依賴性，促進Caspase-3和Caspase-9的剪切，從而誘導卵巢癌細胞凋亡。

綜上所述，木香烴內酯可通過抑制NF-κB基因及蛋白表達，激活Caspase-3和Caspase-9而誘導卵巢癌細胞的凋亡，為卵巢癌的治療提供了新的選擇和思路。

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