電針對嗎啡成癮大鼠中樞多巴胺受體的影響

梁艷,曾亮,高曉悅,張晴,來禎

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電針對嗎啡成癮大鼠中樞多巴胺受體的影響

梁艷,曾亮,高曉悅,張晴,來禎

(上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院,上海 200437)

觀察嗎啡成癮大鼠中腦腹側被蓋區(VTA)、伏隔核(NAc)、前額皮層(PFC)內多巴胺(DA)受體變化及電針的調節作用。30只雄性Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組和電針組,每組10只。采用嗎啡自身給藥成癮大鼠模型,電針組選取雙側T5、L2夾脊穴,電針連續治療4 d。Western Blotting法觀察各組大鼠腦VTA、NAc、PFC內D1、D2受體含量的變化。治療后,相對于模型組,電針組大鼠的嗎啡攝入量明顯減少(＜0.05)。模型組大鼠腦VTA內多巴胺D2受體減少(＜0.05);NAc內多巴胺D1受體增加(＜0.05),D2受體減少(＜0.05);PFC內多巴胺D1受體減少(＜0.05),D2受體增加(＜0.05)。電針治療能調節上述腦區發生變化的D1、D2受體含量,使之趨于正常。電針治療可以在一定程度上抑制成癮大鼠對嗎啡的渴求;嗎啡成癮后多巴胺投射通路中的多巴胺受體發生了一定程度的適應性改變,電針治療可以調節DA受體的異常表達,對嗎啡成癮大鼠的多巴胺受體起到保護作用。

電針;嗎啡依賴;行為,成癮;多巴胺受體

藥物渴求的中樞神經基礎是從中腦腹側被蓋區到前腦的多巴胺投射通路,是阿片類藥物引起精神依賴的軸心部位,也是腦內獎賞通路中藥物作用最敏感部位,同時也是毒品依賴難以戒除的主要原因。多巴胺(DA)及其受體系統在藥物獎賞機制中起重要作用。D1受體可能更多地參與獎賞介導的動機調控,而D2受體可能更多地參與藥物的強化和藥物依賴的獲得。研究證實,藥物成癮是通過抑制多巴胺重吸收或促進多巴胺的釋放增加突觸間隙多巴胺的濃度,高于生理水平的多巴胺作用于相應的DA受體,產生神經適應性和成癮行為。另一方面,DA受體也是多種藥物作用的靶點,藥物通過對其進行拮抗或激動來發揮作用[1]。本研究觀察了電針對成癮大鼠相關腦區中樞多巴胺受體的影響,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30只Wistar大鼠,雄性,體重約250 g,SPF級,購自中國科學院上海實驗動物中心。環境溫度(24±2)℃,明/暗周期12 h,自由飲水,術后單籠飼養,行為學實驗期間每日限食20 g。

1.2 模型制作

參照文獻[2-4]建立大鼠嗎啡自身給藥模型。嗎啡注射液(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司,批號141004-1,10 mg/mL)。

實驗預備期,大鼠開始實驗前適應環境3～5 d。之后采用FR1程序(固定比率為1,大鼠1次觸鼻即可獲得1次獎賞)進行蔗糖訓練,每日訓練2 h,使動物建立觸鼻與獎賞之間的關系。選取蔗糖觸鼻行為訓練穩定的動物行頸靜脈插管手術。

手術及恢復期,腹腔注射戊巴比妥鈉55 mg/kg麻醉,同時給予阿托品0.1 mL。大鼠麻醉后綁定,剪毛,以75%乙醇局部消毒,剪開右側頸部皮膚,分離頸外靜脈,結扎遠心端,在近心端剪V型缺口,將靜脈插管緩慢插入血管至心房上方并結扎,插管游離端,用背心固定,塞入靜脈插管塞封口,縫合創口。術后每日2次經靜脈插管給予0.2 mL青霉素肝素鈉溶液(青霉素40萬u/mL,肝素鈉50 u/mL),用于抗感染和抗凝。

嗎啡自身給藥訓練,采用FR1程序,嗎啡每次注射量為0.75 mg/kg,每日2 h,實驗結束后動物放回飼養籠。

半量實驗,自身給藥訓練最后1 d使用半量程序(FR2,固定比率為2,大鼠2次觸鼻即可獲得1次獎賞),觀察2 h。如動物的嗎啡攝入量保持恒定,說明嗎啡自身給藥訓練(造模)成功。

1.3 動物分組及處理

對照組,與其他組動物相同環境飼養,不予嗎啡造模及治療干預措施。模型組和電針組進行嗎啡造模。電針組,造模成功后給予電針治療,取雙側T5、L2夾脊,連接G6805-2電針儀,連續波,頻率2 Hz,留針20 min,每日1次,連續4 d。穴位選擇參照《實驗針灸學》《實驗動物針灸手冊》的動物穴位圖譜,以比較解剖和骨度分寸法為依據模擬定位。T5夾脊穴位于背部,平第5胸椎棘突下,脊柱旁開0.5寸,左右各一穴。L2夾脊穴位于背部,平第2腰椎棘突下,脊柱旁開0.5寸,左右各一穴。

1.4 觀察指標

大鼠行為學指標,蔗糖溶液給予次數,嗎啡攝入量。

采用Western Blot方法檢測大鼠中腦腹側被蓋區(VTA)、伏隔核(NAc)、前額皮層(PFC)區的D1、D2受體蛋白表達。

1.5 統計學方法

采用SPSS16.0統計軟件進行數據分析。對符合正態分布計量資料采用均數±標準差進行統計描述,組間比較采用或獨立樣本檢驗、或采用方法進行兩兩比較;組內比較采用配對檢驗;對不符合正態分布的計量資料采用非參數檢驗。以＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電針對嗎啡成癮大鼠嗎啡攝入量的影響

2.1.1 兩組蔗糖訓練結果比較

蔗糖訓練期內每組動物連續5 d獲得的0.2 mL 5%蔗糖溶液次數比較均無差異(＞0.05),說明各組動物的蔗糖訓練行為在造模前具有可比性。詳見表1。

表1 兩組蔗糖訓練結果比較 (±s,次)

2.1.2 兩組治療前嗎啡攝入量的比較

重復測量方差分析顯示,兩組間大鼠嗎啡攝入量比較無明顯差異(=1.669,＞0.05),組別與時間之間無交互作用(=1.569,＞0.05),兩組內不同時間大鼠嗎啡攝入量有差異(=2.159,＜0.05),嗎啡成癮造模過程中存在時間差異,嗎啡攝取量隨時間遞增客觀上呈現增多的趨勢,不影響模型穩定。兩組大鼠嗎啡自身給藥9 d后的平均嗎啡攝入量比較無明顯差異(=1.075,＞0.05)。說明各組大鼠的嗎啡攝入量在治療前具有可比性。詳見表2。

表2 兩組治療前嗎啡攝入量的比較 (±s,mg)

2.1.3 兩組半量實驗嗎啡攝入量比較

模型組和電針組大鼠自身給藥1～9 d FR1程序下平均嗎啡攝入量比較,差異無統計學意義(＞0.05)。兩組大鼠自身給藥的第10天,與F1程序比較,兩組在FR2程序下嗎啡攝入量基本不變(＞0.05)。說明動物在變換實驗程序后對嗎啡的渴求沒有降低,提示使用FR2程序后動物對嗎啡的渴求行為是一種渴望得到藥物的表現。詳見表3。

表3 兩組半量實驗嗎啡攝入量比較 (±s,mg)

2.1.4 兩組治療后嗎啡攝入量比較

兩組治療后FR1程序下嗎啡攝入量比較,差異有統計學意義(＜0.05)。詳見表4。

表4 兩組治療后嗎啡攝入量比較 (±s,mg)

注:與模型組比較1)＜0.05

2.2 電針對嗎啡成癮大鼠中腦腹側被蓋區(VTA)D1、D2受體含量的影響

在嗎啡成癮大鼠VTA的D1受體含量方面,各組比較無明顯統計學差異(＞0.05)。說明嗎啡造模及電針治療對大鼠VTA的D1受體含量影響不明顯。在嗎啡成癮大鼠VTA的D2受體含量方面,模型組及電針組D2受體含量較對照組明顯減少,差異具有統計學意義 (＜0.05);與模型組比較,電針組D2受體含量明顯增加,差異有統計學意義(＜0.05)。說明嗎啡造模可以使大鼠VTA的D2受體明顯減少;電針治療能使其含量增加。詳見圖1、表5。

圖1 電針干預后VTA多巴胺D1、D2受體表達比較

表5 3組VTA D1、D2受體含量比較 (±s)

注:與對照組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05

2.3 電針對嗎啡成癮大鼠伏隔核(NAc)D1、D2受體含量的影響

嗎啡成癮大鼠NAc的D1受體含量比較發現,模型組、電針組D1受體含量較對照組明顯增加,差異具有統計學意義(＜0.05);與模型組比較,電針組D1受體含量明顯減少,組間比較差異有統計學意義(＜0.05)。說明嗎啡造模可以使大鼠NAc的D1受體含量增加,電針治療可以減少NAc的D1受體的含量。嗎啡成癮大鼠NAc的多巴胺D2受體含量比較發現,模型組、電針組D2受體含量較對照組明顯減少,差異具有統計學意義(＜0.05);與模型組比較,電針治療后D2受體含量增加,組間比較差異無統計學意義(＞0.05)。說明嗎啡自身給藥模型可以使大鼠NAc的D2受體含量減少,電針治療后NAc的D2受體含量有增加的趨勢。詳見圖2、表6。

圖2 電針干預后NAc多巴胺D1、D2受體表達

表6 3組NAc D1、D2受體含量比較 (±s)

注:與對照組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05

2.4 電針對嗎啡成癮大鼠前額皮層(PFC)D1、D2受體含量的影響

在嗎啡成癮大鼠PFC的D1受體含量方面,模型組、電針組與對照組比較有明顯差異(＜0.05);模型組與電針組比較無明顯統計學差異(＞0.05)。說明嗎啡造模可以使大鼠PFC的D1受體含量明顯減少;電針治療對嗎啡成癮大鼠PFC的D1受體含量影響不明顯。在嗎啡成癮大鼠PFC的多巴胺D2受體含量方面,模型組、電針組與對照組比較有明顯差異(＜0.05);與模型組比較,電針組D2受體含量明顯減少,組間差異有統計學意義(＜0.05);說明嗎啡造模可以使大鼠PFC的D2受體含量增加,電針治療能使其含量減少。詳見圖3、表7。

圖3 電針干預后PFC多巴胺D1、D2受體表達

表7 3組PFC D1、D2受體含量比較 (±s)

注:與對照組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05

3 討論

3.1 選穴依據

臨床研究時對99例海洛因成癮者的脊柱壓痛點進行了統計分析,發現壓痛點集中出現在第5～7胸椎棘突下的人數占總調查人數的72.7%,出現在第2腰椎棘突下的人數占總調查人數23.4%。并且壓痛點的疼痛程度隨軀體癥狀的緩解而逐漸減弱[5]。華佗夾脊穴位于脊柱兩側旁開0.5寸,鄰近背俞穴,刺之可調節臟腑氣血功能;T5夾脊穴正是位于督脈神道附近,具有泄熱清心、安神定志的作用。L2夾脊穴鄰近腎俞穴,腎俞亦屬背俞穴,二穴相配對臟腑、經絡、氣血津液的失調都有很好的調整作用。刺之可泄熱清心、安神定志、培補元氣、溫腎化濁。《素問·長刺節論》中認為:“治寒熱。深專者,刺大藏,迫藏刺背,背俞也。”海洛因依賴者,往往病程長而頑固,病理多為本虛標實,多侵及五臟,取背俞穴往往能取得較好的療效。現代研究[6]表明,腎俞等穴對垂體、腎上腺功能有促進作用,能有效抑制嗎啡戒斷癥狀,針刺腎俞等穴,對長期使用海洛因所致的腎虛諸癥都有較好的調整作用。有研究者[7]利用韓氏穴位神經刺激器針刺雙側足三里和三陰交,發現針刺對海洛因成癮引起的大鼠細胞凋亡有抑制作用,并下調大鼠PAG內caspase-3的表達。

T5、L2夾脊穴對臟腑、經絡、氣血津液的失調都有很好的調整作用。根據辨證取穴理論和近年來各種報道的用穴頻數,并考慮到動物實驗操作中的難易程度,我們選擇雙側T5、L2夾脊穴為治療位點;T5、L2夾脊正是督脈神道、至陽穴附近,兩穴有泄熱清心、安神定志、疏肝理氣的作用,可調節戒毒者的陰陽平衡,達到改善阿片類藥物戒斷者焦慮和抑郁情緒的作用[8]。

3.2 電針對嗎啡成癮大鼠的影響

強迫性反復用藥是藥物成癮的主要特征,無論實驗動物或者臨床患者在脫毒后仍然存在對藥物的渴求。本次實驗研究結果顯示,經過蔗糖、嗎啡誘導已形成穩定嗎啡自身給藥行為的大鼠,在停藥戒斷后,大鼠對嗎啡的渴求并沒有完全消失。這一實驗結果與報道的研究結果是一致的,電針對線索誘導的大鼠海洛因覓藥行為有明顯抑制作用,這可能與扣帶前皮質、伏隔核核區、伏隔核殼區CREB的表達增強及腹側被蓋區抑制有關[9]。也表明大鼠對藥物強化效應所引起的極度欣快的記憶非常深刻。

嗎啡戒斷期間給予電針治療后,大鼠再次返回實驗籠的行為數據顯示,電針組動物的嗎啡攝入量顯著低于模型組(＜0.05),提示嗎啡戒斷時給予電針治療可以顯著抑制成癮大鼠對嗎啡的渴求行為。這一研究結果與其他相關研究機構通過電針結合迷走神經刺激可減少條件線索誘導的大鼠海洛因覓藥行為,增加其活動度的研究結果一致[10];也與通過條件性位置偏愛模型所觀察到的結果具有一致性,電針能抑制或消除大鼠嗎啡CPP表達[11-12],說明電針治療有抑制動物渴求行為的作用。但嗎啡戒斷時電針治療并沒有使動物的覓藥行為消失,而是對動物的覓藥行為起到了一定程度的抑制,而這種抑制效應能維持多久,還有待進一步實驗研究來觀察和驗證。

3.3 電針對嗎啡成癮大鼠相關腦區多巴胺受體的影響及機理探討

多巴胺(DA)能神經元主要分布在紋狀體、VTA及黑質等腦區,形成腦內兩個DA能環路,其中一個為中腦邊緣DA系統(MLDS),是參與獎賞效應的重要作用系統;MLDS神經元胞體位于VTA,屬于A10群胞體,其上行路徑經內側前腦束投射至NAc、嗅結節、額葉皮質的顆粒區、前扣帶回及邊緣葉等的皮質,有些纖維可遠至嗅球、杏仁核和梨狀區皮層質,甚至投射至更為廣泛的大腦皮質;到邊緣系統的投射是情緒和情感的表達中樞,到前額葉皮層的投射參與認知、意識活動;這兩者均與藥物成癮和精神分裂癥有關[13]。中腦-邊緣多巴胺系統、NAc的形態和功能改變是產生阿片類藥物成癮的重要神經基礎。DA受體各亞型選擇性地在中腦邊緣多巴胺系統高度表達,同樣提示DA在阿片類藥物成癮中發揮重要的作用。多巴胺也被一些學者認為是渴求效應產生的最終共同神經遞質,甚至在應激誘發成癮行為和促發復吸中糖皮質激素也通過影響DA系統發揮獎賞效應的強化作用。在急性給藥的情況下,絕大多數成癮藥物通過激活MLDS中NAc和PFC的DA神經通路,實現藥物的獎賞和強化作用;有證據表明NAc、PFC是產生嗎啡強化效果的最終部位[14]。損傷NAc可以顯著降低可卡因、苯丙胺、嗎啡和尼古丁等的自身給藥。

近半個世紀的研究結果已經形成共識,腦內獎賞或強化系統的主要結構——中腦-邊緣多巴胺神經系統,是阿片類藥物引起精神依賴的軸心部位,而且是阿片強化效應的最后通路,中腦-邊緣系統和NAc的形態和功能改變是產生阿片類藥物成癮的重要神經基礎[15-17]。DA受體各亞型選擇性地在中腦邊緣多巴胺系統高度表達,同樣提示DA在阿片類藥物成癮中發揮重要的作用[18]。DA通過D1型受體參與嗎啡引起的運動增強效應,但從作用機理上看,只是對抗嗎啡的運動增強效應,沒有其它的特異始動作用[19];同時D1型DA受體拮抗劑,可減少嗎啡成癮大鼠對環境刺激的反應,即降低了該大鼠感受欣快的反應,增加了大鼠的覓藥動機,又抑制了該大鼠的行為活動,但D2型DA受體則不同,雖降低了該大鼠的覓藥動機,卻不影響該大鼠的行為活動,可見不同DA受體亞型在嗎啡依賴形成過程中發揮不同的作用[20]。本研究小組其他研究結果顯示電針治療雖然降低了動物對嗎啡的渴求和攝入量,但動物對嗎啡的覓藥行為依然存在[19]。這種變化和結果很可能與D1、D2受體的作用存在一定的關系。本次研究結果顯示嗎啡造模可以使大鼠腦VTA、NAc內D1受體含量減少,D2受體含量增加;使PFC內D1受體含量減少,D2受體含量增加;而電針治療則可使各腦區異常的D2受體趨于正常,對NAc內D1受體含量的變化有調節作用,說明電針治療可以調節與嗎啡成癮相關腦區D1、D2受體含量的變化,使之趨向于正常,并且這種作用更明顯地表現在對各腦區D2受體的調節上,可以猜測電針對嗎啡成癮大鼠的干預作用有可能通過對上述腦區D2受體的調節而呈現的。但由于本次研究的樣本量較小,這種猜測還有待后續研究結果來進一步證實。

本次實驗結果顯示電針效應存在一定的累積性,同時也進一步證明了本研究小組前期通過嗎啡和海洛因自身給藥模型觀察到電針對大鼠渴求的抑制效應與刺激量有關。研究說明電針具有調節嗎啡成癮大鼠DA受體的作用,戒斷期內連續電針的刺激并沒有使DA受體恢復至正常水平,這種調節效應在今后的一段時間內能維持多久,還有待進一步的臨床和實驗研究來提供更為有力的臨床和實驗室證據。

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Effect of Electroacupuncture on Central Dopamine Receptor in Morphine-dependent Rats

,,-,,.

,,200437,

To observe the change of dopamine receptor in ventral tegmental area (VTA), nucleus accumbens (NAc) and prefrontal cortex (PFC) in morphine-dependent rats, and the regulation effect of electroacupuncture (EA).Thirty male SD rats were randomized into a control group, a model group and an EA group, 10 rats each. Morphine-dependent rat models were induced by morphine self-administration. In the EA group, bilateral Jiaji points (EX-B2) of T5and L2were selected, and the EA intervention lasted 4 d. Western blotting method was adopted to observe the change of the contents of dopamine receptor D1 and D2 in VTA, NAc and PFC of the rats.After the intervention, compared to the model group, the morphine intake was reduced significantly in the EA group (＜0.05); the level of D2 declined significantly in VTA of rats in the model group (＜0.05); the level of D1 increased significantly and D2 declined significantly in NAc of rats in the model group (＜0.05); the level of D1 declined significantly and D2 increased significantly in PFC of rats in the model group (＜0.05); EA produced regulation effect on the altered contents of D1 and D2 in the cerebral areas mentioned above, approaching the normal level.EA can inhibit the hunger of addiction rats for morphine to some extent; the contents of dopamine receptors in dopamine projection pathway will take adaptive changes after morphine addiction, while EA can regulate the abnormal expressions of dopamine receptors, producing a protective effect on dopamine receptors of morphine- dependent rats.

Electroacupuncture; Morphine dependence; Behavior, Addiction; Dopamine receptor

1005-0957(2018)13-0324-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.13.0324

2017-09-16

國家自然科學基金青年基金項目(81403473);上海市衛生和計劃生育委員會科研課題資助項目(20134292)

梁艷(1976―),女,副主任醫師,博士,Email:dr.liangy@163.com