BriCyte E6和Cytomics FC500流式細胞儀在T淋巴細胞亞群分析中的對比研究

陳 杰，張劍波，汪智英，鮑錦庫(.四川大學生命科學學院生物資源與生態環境教育部重點實驗室，四川 成都 60065；.四川省醫學科學院·四川省人民醫院中心實驗室，四川 成都 6007)

流式細胞檢測技術(flow cytometer technology，FCT)是單克隆抗體及免疫細胞化學技術、激光和電子計算機科學等高度發展及綜合利用的高技術產物。至二十世紀七十年代世界第一臺流式細胞儀問世以來，流式細胞術的發展從未停息。隨著科技的發展和新技術新方法的不斷應用，靈敏度、精密度更高、分析速度更快、自動化程度更高的流式細胞儀不斷推出，流式細胞儀已成為臨床檢測和科學研究中不可或缺的檢驗工具[1]。

近年來，國產流式細胞儀發展迅猛，不僅配置與進口品牌主流機型相當，而且智能化、自動化程度均有所超越。國產流式細胞儀大多采用體積法進行絕對值計數，相對于微球法成本更低。深圳邁瑞公司生產的BriCyte E6型流式細胞儀是國產流式細胞儀的一個代表，配置488 nm和638 nm雙固態激光器，六色熒光檢測通道，利用流量傳感器定量樣本體積進行絕對值計數。Cytomics FC500型流式細胞儀是貝克曼庫爾特公司的主流機型之一，配置488 nm和638 nm雙氣態激光器，五色熒光檢測通道，利用Flow-Count熒光微球進行絕對值計數。本研究以T淋巴細胞亞群分析為例，對E6和FC500兩臺流式細胞儀檢測數據的相關性、一致性及精密度進行評價。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2016年10月至2017年2月在四川省人民醫院做T細胞亞群分析的患者202例。其中男111例、女91例，年齡(39.2±26.5)歲。包括感染性疾病、自身免疫性疾病等患者及健康體檢者，空腹采集3 ml靜脈血于肝素鋰抗凝真空采血管中，室溫(18～25 ℃)保存，6 h以內完成檢測。精密度實驗使用Beckman Coulter公司生產的Immuno-Trol cells質控血，4 ℃保存。

1.2儀器與試劑BriCyte E6流式細胞儀為深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司生產，配套試劑邁瑞T淋巴亞群檢測四色試劑CD45-PerCP/CD3-FITC/CD4-APC/CD8-PE、Supra Rainbow Fluorescent Particl質控微球、Mindray流式細胞儀用溶血劑和鞘液。Cytomics FC500流式細胞儀為Beckman Coulter公司生產，配套試劑有T淋巴亞群檢測四色試劑CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-PE/CD3-PC5、Flow-Check 微球、Flow-Set微球、Flow-Count熒光微球、溶血素OptiLyse C和鞘液。

1.3方法

1.3.1樣本處理及上機檢測 BriCyte E6：取20μLCD45-PerCP/CD3-FITC/CD4-APC/CD8-PE抗體加入流式上樣管中，再用反向加樣法加入50 μl血樣標本，混勻后室溫避光孵育20 min；加溶血素450 μl，震蕩混勻后室溫避光溶血15 min，充分混勻后1 h內完成上機檢測。儀器開機后，打開MRFlow軟件，使用儀器配套的Supra Rainbow Fluorescent Particl質控微球自動完成儀器質控和調定檢測方案的電壓、補償。以CD45通道設閾值，輸入樣本稀釋比，采集5000個淋巴細胞后，軟件自動設門分析得到CD3+細胞、CD3+CD4+細胞、CD3+CD8+細胞所占淋巴細胞的百分比和絕對計數值。Cytomics FC50：取10 μlCD45-FITC/CD4-RD1/CD8-PE/CD3-PC5抗體加入流式上樣管中，再用反向加樣法加入100 μl血樣標本，混勻后室溫避光孵育20 min；加溶血素OptiLyse C 500 μl，震蕩混勻后室溫避光溶血10 min；再加鞘液500 μl，用反向加樣法加入Flow-Count 熒光微球100 μl，充分混勻后1 h內完成上機檢測。儀器開機后，打開CXP軟件，使用Flow-Check和Flow-Set完成儀器質控和PMT電壓調節。以CD45通道設閾值，采集5000個淋巴細胞后，手動設門分析得到的CD3+細胞、CD3+CD4+細胞、CD3+CD8+細胞所占淋巴細胞的百分比，輸入Flow-Count熒光微球的濃度后軟件換算出各群細胞的絕對計數值。

1.3.2精密度實驗 批內CV測定：使用Immuno-Trol cells質控血分別用兩臺儀器在同一時間段內連續加樣檢測20次；日間CV測定：使用Immuno-Trol cells質控血在每天10：00分別用兩臺儀器各加樣檢測一次，連續檢測20天。

1.3.3質量控制 所有實驗均由同一名具有流式操作資格的實驗人員完成。兩臺儀器每日進行常規保養和儀器質控，使用Immuno-Trol cells質控血進行室內質控，并均通過衛生部室間質評。

1.4統計學方法使用Excel 2003和SPSS 19.0軟件進行統計分析。結果采用中位數表示。相關性分析采用線性回歸和多配對標本的非參數檢驗(Friedman檢驗)，P< 0.05為差異有統計學意義。一致性評價采用Bland-Altman法，繪制Bland-Altman圖的橫坐標(Average)為(E6+FC500)/2，縱坐標(Bias)為(E6-FC500)/((E6+FC500)/2)。

2 結果

2.1BriCyteE6和CytomicsFC500流式細胞儀的相關性和一致性

2.1.1T淋巴細胞亞群的百分比結果 兩儀器測得的CD3+細胞、CD3+CD4+細胞和CD3+CD8+百分比結果的判定系數R2均大于0.98，斜率在0.9～1.1，截距在-0.023～0.720，相關性良好(P< 0.05)。Bland-Altman分析顯示，兩儀器CD3+細胞、CD3+CD4+細胞、CD3+CD8+細胞百分比的偏倚在0.50%～2.28%，一致性界限范圍較窄。見表1和圖1。

表1 BriCyte E6和Cytomics FC500 流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群百分比結果的相關性分析 (%)

圖1 BriCyte E6和Cytomics FC500 流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群百分比的Bland-Altman圖a：CD3+細胞百分比結果；b：CD3+CD4+細胞百分比結果；c：CD3+CD8+細胞百分比結果

2.1.2T淋巴細胞亞群的絕對計數值 兩儀器測得的CD3+細胞、CD3+CD4+細胞和CD3+CD8+絕對計數值的判定系數R2均大于0.98，斜率在0.8～1.0，截距在-35.271～17.116，相關性尚可(P< 0.01)。Bland-Altman分析顯示，兩儀器CD3+細胞、CD3+CD4+細胞，CD3+CD8+細胞絕對計數值的偏倚在12.21%～16.09%，一致性界限較寬。見表2和圖2。

表2 BriCyte E6和Cytomics FC500 流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群絕對計數值的相關性分析 (個/μl)

圖2 BriCyte E6和Cytomics FC500 流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群絕對計數值的Bland-Altman圖a：CD3+細胞絕對計數值；b：CD3+CD4+細胞絕對計數值；c：CD3+CD8+細胞絕對計數值

2.2BriCyteE6和CytomicsFC500流式細胞儀精密度結果兩臺儀器的批內CV小于日間CV，百分比CV小于絕對計數值CV，E6的CV小于FC500的CV，特別是兩儀器絕對計數值的日間CV，差異最大。見表3。

表3 BriCyte E6和Cytomics FC500 流式細胞儀測定T淋巴細胞亞群百分比和絕對計數值的精密度結果

3 討論

流式細胞檢測技術還未實現全程自動化，在整個檢測過程中，影響最終結果的因素較多[2]。除了人為操作因素外，不同的儀器對結果的影響也不容忽視。不同流式細胞儀的結果存在差異[3]，實驗室選擇何種儀器，不同儀器間結果是否具有可比性，是目前實驗室面臨的問題[4]。

從實驗結果可看出，E6和FC500百分比結果的相關性和一致性均較好，但兩者結果差異有統計學意義(P< 0.05)。可能是由于使用不同的儀器和不同的配套試劑所致。不過，兩臺儀器均使用四色T淋巴細胞亞群抗體，以CD45/SSC設門，只要注意樣本的充分混勻、適合的樣本抗體比例、適當的電壓補償和正確的設門分析等細節因素，兩臺儀器間百分比結果的差異是可以控制在較小范圍內的。兩臺儀器的絕對計數值結果相關性尚可，但一致性較差。E6絕對計數值明顯高于FC500，主要原因可能是兩臺儀器不同的計數方法。E6使用的是流速校準(flow rate calibratio)計數法，它是體積法的一種，其原理是利用流量傳感器精確測定樣本體積，從而實現絕對計數功能。FC500使用的是熒光參比微球計數法，即在檢測樣本中加入已知濃度的熒光參比微球(Flow-Count)，通過記錄目的細胞與微球的數量，經軟件換算得到絕對計數值。對于基于這兩種不同計數方法儀器的比較，王維維等[5]也得到了類似結果，并建議保持儀器使用的延續性，避免因方法學不同給結果帶來的差異。

在精密度實驗中，Immuno-Trol cells質控血因穩定性好，保存時間長，能更準確地觀察兩臺儀器的日間精密度。從實驗結果可看出，兩臺儀器百分比結果的精密度接近，而絕對計數值的精密度E6明顯優于FC500，特別是絕對計數值的日間精密度差異最大，探尋其原因可能還是主要源自于不同的計數方法。基于體積法的E6，其計數的誤差主要來源于樣本前處理中加樣的準確性，而基于微球法的FC500，人工操作環節更多，還要受熒光微球濃度的準確性、穩定性等因素的干擾[6]。越來越多的研究數據表明，體積法的儀器要比微球法的儀器重復性更好，而且操作簡單，利于推廣[7]。

E6消除了微球法儀器微球需混勻、長時間檢測沉底、濃度不均一、對采集數量有要求等缺點。不過，E6需對樣本前處理中的移液量進行精確控制并設置正確的稀釋比，而且還需要定期使用BD Trucount管對儀器進行絕對計數的校準和定期對移液器進行校準。兩臺儀器的絕對計數法各有優缺點，無論選擇何種儀器，實驗室必須嚴格做好室內質控和參加室間質評，以保證檢驗結果的可靠性。

目前，我國T淋巴細胞亞群分析還沒有標準化方案，選擇干擾因素更少、精密度更好的流式細胞儀能為臨床和科研提供更準確的檢測結果。隨著流式前處理系統和智能分析軟件的廣泛應用，甚至是全自動流式細胞儀的研發上市，都將極大提高流式檢測的精密度和準確度，屆時，我國建立流式質量控制體系和流式項目標準化方案將指日可待。

[1] 趙嬋娟，袁粒星，童煜.流式細胞儀及其在醫學研究中的應用[J].中外醫學研究，2016，14(22)：160-162.

[2] 吳麗娟，劉霞，趙文利.流式單平臺和雙平臺計數定量檢測外周血淋巴細胞亞群的實驗研究[J].國際檢驗醫學雜志，2012，33(2)：143-145.

[3] 黃春梅，郭野陳，倩劉定，等.不同流式細胞分析系統對外周血淋巴細胞亞群分析結果的影響[J].中華檢驗醫學雜志，2011，34(5)：403-408.

[4] Whitby L，Whitby A，Fletcher M，et al.Current laboratory practices in flow cytometry for the enumeration of CD4(+) T-lymphocyte subsets[J].Cytometry B Clin Cytom，2015，88(5)：305-311.

[5] 王維維，奚迪，袁向亮，等.不同流式細胞分析儀檢測淋巴細胞亞群的比較研究[J].中華檢驗醫學雜志，2016，39(5)：361-364.

[6] 胡曉蕾，周靈玲，趙志鋼.單系統與雙系統流式細胞術 T 細胞亞群絕對計數的比較[J].檢驗醫學，2016，31(7)：593-598.

[7] 李君華.流式細胞儀絕對計數方法及其臨床應用[J].國際輸血及血液學雜志，2016，39(6)：544-548.