Parkin在肺鱗狀細胞癌中的表達及其與臨床病理特征的相關性研究

孫 羽，何 燕，彭星辰(四川大學華西醫院頭頸部腫瘤科，四川 成都 610041)

Parkin基因是在帕金森病的研究中被鑒定出來，近期的研究顯示Parkin在多種腫瘤中發生缺失和突變[1，2]，如宮頸癌(5.6%)、結腸直腸癌(2.4%～5.6%)、胃癌(4.6%)、皮膚黑色素瘤(3.5%)、肺腺癌(2.7%～3.1%)和子宮內膜樣癌(2.1%)[3，4]。Parkin的缺失和突變會導致腫瘤的發生，提示Parkin為抑癌基因。目前多數關于Parkin與肺癌關系的研究是通過動物實驗來實現，使用人類組織標本進行的研究偏少[3～6]。在本研究中，我們通過檢測Parkin在肺鱗狀細胞癌中的表達水平，分析其與肺鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系，初步揭示Parkin在肺鱗狀細胞癌中的作用。

1 材料與方法

1.1材料收集2016年1月至2017年1月在我院行手術切除并經術后病理確診為肺鱗狀細胞癌的60例患者的手術病理標本。納入標準：①為單純肺鱗狀細胞癌的患者，未合并其他的惡性腫瘤；②符合臨床診斷及病理診斷標準。其中男50例，女10例，年齡(57.5±12.5)歲，高、中、低分化的患者各20例，淋巴結轉移患者31例，遠處轉移13例。試劑及儀器:Parkin抗體(Santa Cruz sc-32282，Santa Cruz Biotechnology)；石蠟切片機(LEICA RM2255)；電熱恒溫干燥箱(GZX-DH.300BS-Ⅱ，上海躍進醫療器械有限公司)；低溫生化培養箱(上海躍進醫療器械有限公司)，染色機(Leica.Autostainer XL 四川泰運醫療器械有限公司)。

1.2方法將在病理科收集到的標本的石蠟塊，進行連續切片，片厚約3.5 μm，常規HE染色用自動染色機(Leica.Autostainer XL)染色。免疫組織化學染色(為二步法)：在70 ℃的烤箱中放置石蠟切片1 h；切片脫蠟：依次放入三瓶二甲苯中，每瓶浸泡10 min，再依次放入95%、95%、80%的乙醇中，每瓶浸泡2 min；依次用自來水和蒸餾水沖洗，每次20秒，用PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min；用高溫高壓法修復組織：用高壓鍋加熱EDTA PH8修復液，將切片放入沸騰的修復液中，待高壓鍋閥門噴氣開始計時，修復時間持續3 min；用流水沖洗已停止噴氣的高壓鍋，為其降溫，再在室溫中靜置15 min；用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次3 min；為清除內源性過氧化物酶，將切片浸泡在3%過氧化氫水溶液中5 min；8)用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次3 min；擦干切片組織周圍的液體，滴加一抗；放入4 ℃冰箱內過夜；用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次3 min，甩掉一抗；滴加聚合物增強劑(流程及要求同之前的一抗)，室溫下孵育15～20 min；用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次3 min；進行DAB顯色，顯色時間5 min左右；用蘇木素復染細胞核，持續時間為30秒；分化、返藍，并隨機抽取幾張切片鏡下觀察；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中心樹膠封片。

1.3免疫組化的結果判斷標準在高倍光學顯微鏡下(×100倍)觀察切片組織染色情況，組織的染色強度為0～3(即不存在、輕度、中度和強烈)；被染色細胞的百分比也被得分為0～3分(即0分0%～5%；1分6%～25%；2分26%～50%；3分51%～100%)，Parkin蛋白染色分數=組織的染色強度評分分數×被染色細胞百分比的評分分數。

1.4統計學方法應用GraphPad Prism 5統計軟件數據分析。采用均數±標準差表示計量資料，多組樣本比較采用非參數的方差分析，兩兩間的比較采用的非參數t檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1不同分化程度的癌組織的Parkin表達在高、中、低分化的肺鱗狀細胞癌的組織切片中Parkin蛋白的染色分數分別為(6.100±1.410)、(2.800±1.642)及(1±1.076)，三組之間差異均有統計學意義(P< 0.0001)，肺鱗癌的分化程度越低，Parkin蛋白的染色分數越低。

圖1 肺鱗狀細胞癌組織的病理染色(×100)a：高分化組的Parkin染色；b：中分化組的Parkin染色；c：低分化組的Parkin染色；d：高分化組的HE染色e：中分化組的HE染色；f：低分化組的HE染色。

2.2在肺鱗狀細胞癌原發灶中Parkin表達水平與淋巴結轉移的關系在淋巴結轉移陽性組及陰性組中，Parkin蛋白在肺鱗狀細胞癌原發灶中的染色分數分別(1.677±1.701)，(5.103±2.059)，t=7.046，df=58。淋巴結轉移陽性組的Parkin蛋白在原發灶中的染色分數明顯低于淋巴結轉移陰性組，差異有統計學意義(P< 0.0001)。

2.3在肺鱗狀細胞癌原發灶中Parkin染色分數與遠處轉移的關系在存在遠處轉移組及不存在遠處轉移組中，Parkin蛋白在肺鱗狀細胞癌原發灶中染色分數分別為(0.462±0.776)，(4.170±2.190)，t=5.971，df=58。存在遠處轉移組的Parkin蛋白在原發灶中的染色分數明顯低于無遠處轉移組，差異有統計學意義(P< 0.0001)，存在遠處轉移組的Parkin蛋白在原發灶中的染色分數明顯低于無遠處轉移組。

圖2 在高倍光學顯微鏡下(*100倍)肺鱗狀細胞癌原發灶中Parkin的免疫組化染色分數與淋巴結轉移的關系。a：淋巴結轉移陽性組；b：淋巴結轉移陰性組。

圖3 在高倍光學顯微鏡下(*100倍)肺鱗狀細胞癌原發灶中Parkin的免疫組化染色分數與遠處轉移的關系。a：遠處轉移組；b：無遠處轉移組。

3 討論

我國肺癌的發病率及死亡率久居惡性腫瘤的第一位[7]。近些年針對肺癌治療方面的研究發現，肺腺癌組織亞型中存在可治療的分子靶點，針對這些靶點已經獲準生產的藥物，在治療晚期肺癌上已取得令人矚目和興奮的進展[8，9]。但遺憾的是目前針對肺鱗狀細胞癌或小細胞肺癌還沒有發現可治療的分子靶點[10]。而肺鱗狀細胞癌又是肺癌中最常見的一種類型。發掘可用于藥物研發的肺鱗狀細胞癌新型生物靶點，將具有非常重要的意義。

目前多數研究是通過動物實驗來闡明Parkin與肺癌的關系，使用人類組織標本的研究偏少[3～6]。本課題通過免疫組化檢測Parkin在人肺鱗狀細胞癌中的表達水平，分析其與肺鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系，初步揭示Parkin在肺鱗狀細胞癌中的作用。本研究結果顯示肺鱗狀細胞癌的分化程度越低，Parkin蛋白的染色分數越低；淋巴結轉移陽性組的Parkin蛋白在原發灶中的染色分數明顯低于淋巴結轉移陰性組；存在遠處轉移組的Parkin蛋白在原發灶中的染色分數明顯低于無遠處轉移組。

既往的研究發現在惡性腫瘤中頻繁發生Parkin的缺失或突變[1，2]。如Poulogiannis等將敲除Parkin的3號外顯子的老鼠與APC/min的老鼠進行雜交，發現腸道腺瘤的發病率升高及腺瘤發生時間提前[11]。Fujiwara等通過敲除Parkin的3號外顯子繁育出Parkin-/-的小鼠，與野生型小鼠相比，Parkin小鼠更容易發生原發性肝細胞癌(HCC)[12]。Sun等利用小分子的干擾RNA(siRNAs)來抑制了小鼠細胞內的Parkin表達，發現Parkin表達的缺失刺激了胰腺癌細胞的增殖和擴散[13]。上述研究均表明Parkin具有抑制腫瘤的功能，支持本課題的觀點。

綜上所述，肺鱗狀細胞癌的分化程度越低，Parkin蛋白的染色分數越低；淋巴結轉移陽性組的Parkin蛋白在原發灶中的染色分數明顯低于淋巴結轉移陰性組；存在遠處轉移組的Parkin蛋白在原發灶中的染色分數明顯低于無遠處轉移組。揭示了Parkin可能可以抑制肺鱗狀細胞癌的發生、發展，為Parkin基因治療在肺鱗狀細胞癌中的使用提供了基礎研究的數據。

[1] Kitada，Asakawa S，Hattpri N，et al.Mutation in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism[J].Nature，1998，392：605-608.

[2] Quinsay MN，Lee Y，Rikka S，et al.Bnip3 mediates permeabilization of mitochondria and release of cytochrome c via a novel mechanism[J].J Mol Cell Cardio，2010，48(6)：1146-1156.

[3] Cerami E，Gao J，Dogrusoz U，et al.The cBio cancer genomics portal：an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data[J].Cancer Discov，2012，2：401-404.

[4] Gao J，Aksoy BA，Dogrusoz U，et al.Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal[J].Sci Signal，2013，6(269)：pl1.

[5] D’Amico AG，Maugeri G，Magro G，et al.Expression pattern of Parkin isoforms in lung adenocarcinomasl[J].Tumor Biology，2015，36(7)：5133-5141.

[6] SeungBaek Lee，Jun She，Bo Deng，et al.Multiple-level validation identifies PARK2 in the development of lung cancer and chronic obstructive pulmonary diseasel[J].Oncotarget，2016，7 (28)：44211-44223.

[7] Wangqing Chen，Rongshou Zheng MPH，Peter D，et al.cancer statistics in China，2015[J].CA，2016，2(66)：115-132.

[8] Reck M，Heigener DF，Mok T，et al.Management of non-small-cell lung cancer：recent developments[J].Lancet，2013，382：709-719.

[9] Mok TS.Personalized medicine in lung cancer：what we need to know[J].Nat Rev Clin Oncol，2011，23；8(11)：661-668.

[10]Byers LA，Rudin CM.Small cell lung cancer：Where do we go from here [J].Cancer，2015，121：664-672.

[11]Poulogiannis G，McIntyre RE，Dimitriadi M，et al.PARK2 deletions occur frequently in sporadic colorectal cancer and accelerate adenoma development in Apc mutant mice[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010，107：15145-15150.

[12]Fujiwara M，Marusawa H，Wang HQ，et al.Parkin as a tumor suppressor gene for hepatocellular carcinoma[J].Oncogene，2008，27：6002-6011.

[13]Sun XD，Liu M，Hao JH，et al.Parkin deficiency contributes to pancreatic tumorigenesis by inducing spindle multipolarity and misorientation[J].Cell Cycle，2013，12：1133-1141.