乙型肝炎共價閉合環狀DNA的形成機制和影響因素

葉雨笙，朱紫衣，彭 燕，常 凱，江忠勇，熊 杰

(成都軍區總醫院檢驗科，四川 成都 610083)

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是由HBV感染致病的一種以肝損害為主要表現的疾病，由于其發病率高，并發和繼發病癥嚴重，已成為了一種危害社會公共衛生安全的疾病，每年約有650 000人死于慢性乙型肝炎引起的肝硬化失代償、肝癌等繼發癥[1]。雖然疫苗以及核酸類似物(NAs)有效地降低了CHB的發病率和死亡率，但CHB仍難以治愈，其主要原因是HBV難以徹底被清除。基礎和臨床研究表明，乙肝病毒共價閉合環狀DNA(covalently closed circle DNA，cccDNA)的存在是HBV持續存在的來源[2]。本文就HBV-cccDNA的形成及其形成的影響因素進行一個簡要綜述，為進一步探尋清除cccDNA方法或策略提供思路。

1 cccDNA在HBV的生命周期中的作用

HBV是由部分雙鏈的松弛環狀DNA(relaxed circular partially double-stranded DNA，rcDNA)、病毒核衣殼以及包膜蛋白構成的嗜肝病毒。HBV通過血流和淋巴系統進入人體，通過靶向結合肝細胞表面的鈉離子牛磺膽酸共轉運多肽(NTCP)進入細胞內[3]，rcDNA通過核衣殼轉運進入細胞核，利用宿主細胞的核酸復制轉錄系統形成cccDNA。cccDNA是一個共價閉合環狀DNA，以微型染色體的形式存在于細胞核內，提供了pgRNA(pregenomic RNA)在內的所有病毒mRNA的轉錄模板[4]。pgRNA同時翻譯出核心蛋白和DNA聚合酶蛋白，并在胞質中與聚合酶和核心蛋白等組裝形成核衣殼復合體；pgRNA在核衣殼內DNA聚合酶幫助下，進行逆轉錄形成新的DNA，新形成的DNA一部分裝配成成熟的病毒dane顆粒釋放入血，另一部分重新入核補充核內的cccDNA。cccDNA是病毒的復制周期中的一個重要中介體，它的存在為病毒復制、轉錄、翻譯的順利進行提供了重要的物質基礎[5～7]，鑒于cccDNA在正常病毒周期的必要性，眾多學者積極開展了cccDNA形成的探索。

2 cccDNA形成機制及其影響因素

HBV-cccDNA形成開始于HBV感染肝細胞數小時后[8]，但目前cccDNA形成的具體機制尚未明確，cccDNA形成可能途徑大致有以下三種機制：

2.1由rc-DNA到cccDNA形成路徑及其影響因素rcDNA是HBV基因組存在重要形式，結構為雙鏈缺口環狀DNA，其中外環負鏈包含了重疊的病毒DNA聚合酶、前C/C、前S1/前S2/S、HBX的4個可閱讀框，正鏈提供了病毒DNA聚合酶所需的不確定長短的缺口[9]。cccDNA是一個閉合的、高度螺旋的雙鏈DNA分子，rcDNA以及cccDNA的結構簡圖如圖1.有研究顯示rcDNA和cccDNA在感染肝細胞中分別分布于胞質和胞核這一特點[10]，提示了rcDNA是cccDNA的前體。鑒于rcDNA與cccDNA結構差異，提示rcDNA到cccDNA需要兩個內容：其一，去除rcDNA的負鏈5’端多余的DNA聚合酶蛋白，負鏈冗余的重復序列r3或r5和正鏈5’端RNA引物；其二，修補和連接環狀DNA存在的缺口。

圖1 rcDNA和cccDNA的結構簡圖a：rcDNA，外環為負鏈，其5’端有DNA聚合酶(黑色實心橢圓)，內環為正鏈，其5’端有RNA引物(波浪線)；b：cccDNA，外環為負鏈，內環為正鏈，兩條鏈均閉合。

2.1.1rcDNA形成DP-rcDNA 而后轉運入細胞核DP-rcDNA(deproteinized-rcDNA)是除去rcDNA負鏈5’端DNA聚合酶蛋白的環狀雙鏈DNA，包含了rcDNA全部的遺傳信息，同時發現其正鏈是完整的，僅僅是正負鏈斷端沒有閉合，其空間構像接近于cccDNA。DP-rcDNA是在乙肝病毒轉染肝細胞的研究中發現的[10，11]，用HBV轉染來自不同物種和細胞類型的22個細胞系，發現所有細胞系中均存在DP-rcDNA[12]。另有研究發現，DP-rcDNA在HBV感染的宿主細胞中大量存在，且在胞質和胞核中分布不均，主要存在于變形的病毒核衣殼中，將DP-rcDNA轉入肝細胞后可檢測到HBV-cccDNA，而對DP-rcDNA核轉運蛋白α和β的轉錄水平的干擾后，導致胞質中DP-rcDNA的積聚以及核內DP-rcDNA、cccDNA的減少，提示了DP-rcDNA可能是cccDNA前體。研究發現DP-rcDNA形成發生的地點是在細胞質內的核衣殼中，在胞質和胞核內都分布著DP-rcDNA，細胞質內DP-rcDNA的出現要早于細胞核內cccDNA的形成，推測DP-rcDNA的形成發生在胞質，而后被轉運入細胞核[10，13]。

細胞絲氨酸蛋白酶可以通過蛋白水解作用催化DNA聚合酶的去除，使用絲氨酸蛋白酶抑制劑可以特異性的抑制此反應，使DP-rcDNA的形成受到抑制，提示了細胞絲氨酸蛋白酶可能是DP-rcDNA形成重要的限速步驟[13]。絲氨酸蛋白酶的水解作用會使負鏈5’端遺留下原本屬于DNA聚合酶的氨基酸殘基，至少直接與負鏈連接的酪氨酸殘基會被遺留下來，而且不會破壞負鏈5’端的核苷酸序列[13]。對核衣殼內DP-rcDNA結構的分析發現所有DP-rcDNA的正鏈都是完整的[10，13]，證明有病毒DNA聚合酶或者已經包裹入核衣殼內的宿主因子催化了正鏈的合成，補齊了正鏈的缺口。實驗證明在DP-rcDNA的形成過程中DNA聚合作用是必不可少的，由此推測有可能DNA聚合酶被從負鏈5’端切除后，催化了正鏈3’端的缺口的補齊，但具體是宿主或是病毒的DNA聚合酶參與，還是兩者協同參與需要進一步的研究[10，13～15]。經過上述步驟后DP-rcDNA具有以下結構特點：負鏈5’端共價連接著氨基酸殘基，兩端保留著重復冗余的序列r3和r5，正鏈缺口已經被補齊。由rcDNA到DP-rcDNA核酸結構的變化觸發了核衣殼發生某種結構變化，使原本包裹在完整核衣殼中的核心蛋白羧基端的核定位信號暴露出來，暴露出來的核定位信號與核轉運蛋白α、核轉運蛋白β結合，而后介導核衣殼內DP-rcDNA轉運進入細胞核內。在入核前DP-rcDNA已經脫離核衣殼，在細胞核內完成cccDNA形成所需的后續步驟[13，16]。

2.1.2細胞核內DP-rcDNA 形成cccDNA被轉運入細胞核內的DP-rcDNA上DNA聚合酶已被去除，正鏈完整，DP-rcDNA的結構更加接近cccDNA，但是仍然需要各種酶系統切除負鏈末端重復序列r3或者r5、5’端氨基酸殘基、正鏈5’端RNA引物，最后連接正負鏈。鑒于對細胞核內cccDNA形成機制認識的局限性，無法用病毒自身因素來解釋這一過程，極大可能病毒利用了宿主酶系統完成了cccDNA的最終合成。

DP-rcDNA負鏈冗余部分切除可能有以下兩種模式：至少多數rcDNA負鏈冗余序列的去除發生在5’r[17]，意味著極有可能宿主細胞的某種限制性核酸內切酶催化切除了負鏈5’端r序列下游的某一位點，使5’端r序列以及共價連接在上面的氨基酸殘基一并被去除；另一種可能是，宿主某種限制性核酸內切酶催化切除負鏈3’端的r序列，同時宿主細胞酪胺酰-DNA-磷酸二酯酶(tyrosyl-DNA phosphodiesterase，TDP2)斷開酪氨酸殘基與HBV負鏈之間的磷酸二酯鍵，使氨基酸殘基去除，TDP2催化的反應與拓撲異構酶Ⅱ上酪氨酸與DNA5’端磷酸基連接的共價鍵斷裂的反應類似[18，19]。兩種模式中限制性核酸內切酶都會使負鏈核苷酸部分缺失，這兩種模式可能互為補充，能保證不同微環境肝臟細胞中cccDNA順利形成。

DP-rcDNA正鏈5’端RNA引物的切除可能與真核生物岡崎片斷上RNA引物的去除機制相似：復制蛋白A(replicationprotein-A，RPA)是一種單鏈DNA結合蛋白質(single-stranded DNA-binding protein，SSB)，RPA結合在DNA單鏈上的RNA引物處形成一個核酸鏈-RPA初級復合體，此初級復合體召集具有核酸內切酶活性的Dna2蛋白質，而后形成一個核酸鏈-RPA-Dna2三元復合體，隨后Dna2切除部分RNA-DNA結合片段，Dna2可以不借助其它核酸內切酶的幫助獨自催化完全切除RNA引物，也可以在核酸酶Fen1、Exo1以及核糖核酸酶RNase HI等的協助共同切除RNA引物[20～22]。如果DP-rcDNA正鏈RNA引物果真如上述機制被去除，那么各種內切酶在切除RNA引物時會不可避免的造成正鏈上DNA核苷酸部分缺失。

經過以上步驟，正負鏈的多余結構已經被成功的去除，但限制性核酸內切酶使負鏈的核苷酸部分缺失，負鏈需要得到修復，宿主的DNA修復系統特別是Y家族的DNA聚合酶參與了跨損傷DNA合成(translesion DNA synthesis，TLS)[23，24]。

DNA聚合酶k(DNA polymerase κ，POLK)是一種參與TLS的宿主Y家族DNA聚合酶，實驗證明POLK在cccDNA形成過程中發揮了重要作用，推測POLK可能在細胞核內參與正、負鏈的修復，為正、負鏈連接成環做最后準備。在哺乳動物細胞內有15種不同的DNA聚合酶，它們具有基因組復制、DNA修復、對損傷DNA進行跨損傷復制的功能，這15種DNA聚合酶可能參與催化正負兩條鏈修復、cccDNA的形成。實驗發現沉默宿主POLK基因可以明顯減少cccDNA的形成，而在已沉默POLK基因且cccDNA合成受抑制的細胞中，POLK的異位表達可以明顯緩解對cccDNA抑制，這證明POLK參與了cccDNA的形成，并且發揮了重要的作用[22]。同一實驗中，另外兩種宿主DNA聚合酶POLL(DNA聚合酶L)和POLH(DNA聚合酶H)被發現擁有POLK類似的效應，參與了cccDNA的形成，但是其促進cccDNA形成的能力相對POLK低很多[15，23]。

在cccDNA形成的最后階段，宿主細胞的DNA連接酶如DNA連接酶Ⅰ或DNA連接酶Ⅱ有可能催化正、負鏈連接成閉合環狀，最終形成cccDNA，cccDNA轉錄形成包括pgRNA在內的各種RNA，逆轉錄成子代rcDNA以及翻譯成各種病毒蛋白質，然后裝配成成熟的病毒Dane顆粒，釋放入血或者重新補充細胞核內的cccDNA。

最近發現前m-RNA加工因子31(pre-mRNA processing factor，PRPF31)和乙肝病毒X蛋白HBx共同影響cccDNA的合成[25]，但是它們具體作用于cccDNA形成過程中的哪一步以及其機制并不是十分明確。PRPF31是從近1000種涉及DNA損傷應答、表觀遺傳等宿主基因中篩選出的，它和cccDNA形成有關。用小干擾RNA干擾PRPF31的表達導致了cccDNA形成減少，而具有抵抗小干擾RNA干擾能力的PRPF31的順利表達則可以使cccDNA的形成得到恢復，說明PRPF31參與了cccDNA的形成，并在其中發揮了重要的作用。同時發現HBx和PRPF31的相互作用對cccDNA的形成十分重要，HBx或者PRPF31各自的過度表達對cccDNA的形成沒有影響，但是兩者共同過度表達卻可以明顯促進cccDNA的形成。PRPF31是細胞核內mRNA拼接過程中的剪接體復合物的組成成分，參與RNA剪接與加工[26]，涉及RNA剪接加工的相關因素可能會影響DNA損傷應答與修復[27]，細胞核中cccDNA最終形成可能利用了宿主DNA損傷應答與修復系統，PRPF31是否通過影響此系統參與cccDNA形成，這方面需要更深入的研究。

2.2由dsl-DNA到DP-dslDNA再到cccDNA的形成路徑及其影響因素dsl-DNA(double-stranded linear DNA)是一種線性的雙鏈DNA，它是不同于rcDNA乙肝病毒基因組的另一種存在形式。在合成rcDNA的過程中，首先以pgRNA為模板逆轉錄形成負鏈，隨后除5’端帽蓋結構的18個核苷酸序列外的pgRNA被RNA酶降解，然后以此pgRNA帽蓋結構為引物、負鏈為模板合成正鏈。正鏈延伸過程中，pgRNA引物從與負鏈的3’端(Dr1上)轉位到負鏈的5’端的Dr2，DNA負鏈末端的Dr1允許正在延伸的正鏈的3’端從負鏈的5’端向3’端轉移，使rcDNA環化。某些情況下pgRNA引物沒能發生轉位，而是處在原位的負鏈Dr1處，此時正鏈延伸形成了一條線性的雙鏈DNA(dsl-DNA)[28]。RcDNA，dsl-DNA的合成如圖2。dsl-DNA具有活躍的非同源重組能力，可經分子內非同源重組合成cccDNA[29]，它是病毒DNA整合入宿主細胞基因組的優先前體，與宿主細胞癌變有關[30]，去除dsl-DNA負鏈5’端的DNA聚合酶形成去蛋白dsl-DNA(deproteinized double stranded linear DNA，DP-dslDNA)。與DP-rcDNA的形成相似，DP-dslDNA形成的部位也是在細胞質中然后被轉運入細胞核[12]。

圖2 RcDNA、dsl-DNA合成示意圖Dr1、Dr2為短的重復序列，第一橫排為已合成的DNA負鏈和pgRNA帽蓋結構引物；第二橫排左側為pgRNA引物從負鏈的3’端轉位到5’端，右側為pgRNA未完成轉位，正鏈在原位延伸直接合成線性dsl-DNA；第三橫排為pgRNA引物轉位后合成環狀的rcDNA。

線性DP-dslDNA通過分子內的非同源重組可以形成環形的cccDNA，非同源重組的基本特征使cccDNA連接端存在著基因的插入或者刪除。因此，經由dsl-DNA-DP-dslDNA-cccDNA與傳統規范復制途徑(由rcDNA-DP-rcDNA-cccDNA)形成的cccDNA相比，存在一些變異，每個復制周期所得到的子代DNA與親代的DNA并不完全相同，稱此病毒復制途徑為非規范復制途徑。新形成的cccDNA，大部分在非同源重組過程中產生了基因遺失或者插入，破壞了pgRNA形成、負鏈合成等后續步驟的能力，不能進入病毒復制周期，而由DP-dslDNA形成的cccDNA中的一小部分，幸運的保留了功能結構，能夠通過形成dsl-DNA中間體合成新的子代cccDNA。相關研究發現，此非規范復制途徑可以獨立存在于個體細胞中，復制效率相對規范復制途徑更低。此過程中，一些cccDNA連接端的序列改變可能會使其重新回到傳統規范復制途徑，即從rcDNA到cccDNA的復制周期中。[29]

非規范復制途徑中由dsl-DNA形成cccDNA極有可能利用了宿主的DNA修復系統，從線性dsl-DNA連接成環狀cccDNA類似于DNA斷裂雙鏈的修補，哺乳動物中DNA雙鏈斷裂(double strand break，DSB)有同源重組(homologous recombination，HR)和非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)兩種修復機制[31]，dslDNA形成cccDNA即通過分子內的非同源末端連接(NHEJ)完成了DNA斷裂雙鏈的修補，宿主的NHEJ DNA修復系統在此過程中發揮著必不可少的作用，但對由rcDNA形成cccDNA的途徑并不是必需的。DNA結合蛋白Ku80是NHEJ DNA修復系統的組成部分，參與了dslDNA形成cccDNA并在其中發揮了重要作用[12]。

2.3由rcDNA到TR-dslDNA再到cccDNA途徑及其影響因素對細胞內已經形成的cccDNA的序列分析發現，除以上提到的RNA引物轉位失敗形成的dslDNA，cccDNA可能還來源于另外一種線性DNA：末端重復的線性雙鏈DNA(double-stranded linear DNA containing terminal repeats，TR-dslDNA)，在Dr1和Dr2之間粘性末端區域有重復，來源于rcDNA[12，32]。rcDNA負鏈的3’端延伸到正鏈5’端的DR2區域上，導致與正鏈配對的負鏈的5’端移位，形成一個部分雙鏈的線性分子：TR-dslDNA，其兩端可以通過分子內的非同源重組形成cccDNA。盡管通過cccDNA的序列分析可以推測TR-dslDNA的存在，但迄今為止沒有直接檢測到它，可能因為細胞核內DP-rcDNA直接形成TR-dslDNA，而對細胞核內DNA的提取方法影響了其檢測。通過此途徑經非同源重組形成的cccDNA與經由dsl-DNA非同源形成的cccDNA具有相似的結構，cccDNA的連接端也存在基因刪除或插入[32]。由于目前還未直接檢測到TR-dslDNA，只能推測與dsl-DNA途徑類似，宿主NHEJ DNA修復系統以及重要組成部分Ku80在由TR-dslDNA到cccDNA的形成過程中也扮演著必不可少的角色。

cccDNA形成的三條可能途徑以及其影響因素的示意簡圖如圖3。

圖3 由dsl-DNA，rcDNA以及TR-dslDNA形成cccDNA的三種途徑以及參與其中的影響因子六邊形代表核衣殼，波浪形代表RNA引物，黑色橢圓實心代表DNA聚合酶。

3 結語

cccDNA在HBV的持續感染中的重要性已經得到了證實，對慢性乙型肝炎的治療應該以抑制cccDNA形成為基礎。由于HBV-cccDNA形成多途徑多機制的復雜性，人們對相關機制和影響因素認識仍然不足，目前研究藥物對cccDNA的形成缺乏針對性，導致HBV的來源無法徹底或者有效的阻斷[33]，所以進一步研究和確認HBV的cccDNA形成和形成機制，有利于從根本或新的角度設計和探索消滅、去除HBV的策略和藥物，進而提高HBV防治水平，相信隨著更多工作的展開，攻克HBV的治療難題一定會在不久的將來實現。

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