食品中豬源性成分檢測方法研究進展

程 浩李明生,2陳士恩丁功濤田曉靜熱孜萬古力·賽買提杜江龍高丹丹

(1. 西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2. 生物醫學研究中心，甘肅 蘭州 730030)

近年來中國食品安全方面的問題仍然較為嚴峻，在食品消費市場中不同肉類之間價格差異較大，一些不法分子將低價肉進行加工售賣給消費者，更嚴重的是利用病死豬進行加工、販賣銷售[1]。隨著食品分析檢測技術的發展，目前建立了多種檢測方法。其中基于DNA的方法包括：聚合酶鏈反應技術(PCR)、限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應技術(RFLP)、實時定量熒光PCR (Real time PCR)和隨機擴增多態性DNA標記技術(RAPD)。基于蛋白質的方法包括：免疫學法、雙向凝膠電泳(2-DE)。其他方法：光譜分析、色譜、質譜和電子鼻[2]。截至目前這些方法在食品豬源性成分檢測中都有很好的實用性和發展前景，本文將對這些檢測方法的原理、最新研究進展、優缺點進行闡述分析，為建立科學、精確、快速、高通量的檢測方法提供一定的依據。

1 基于DNA的豬源性成分檢測技術

1.1 聚合酶鏈式反應PCR

PCR技術是在模板DNA和引物與4種脫氧核苷酸存在的條件下，利用DNA聚合酶催化反應，然后在體外擴增特異性DNA片段的技術。使用PCR法鑒別食品中的動物源性成分，主要是利用動物線粒體DNA片段的特異性來設計引物，然后進行PCR擴增得到目的片段，最后用瓊脂糖凝膠電泳進行分離，由于每種動物DNA擴增片段的大小不同，可以檢測到動物源性成分[3]。Bartlett等[4]建立了鑒定動物源性的PCR方法。Safdar等[5]將馬、大豆、綿羊、家禽、豬肉和牛肉等混合加熱后提取DNA，分別擴增其線粒體細胞色素B、凝集素、12S rRNA、12S rRNA片段，建立了一種可以快速和常規檢測到食品中的動物源性成分的多重PCR檢測方法，且對每一物種的最低檢測限為0.01%。李鑫等[6]根據豬線粒體cybt基因設計引物后進行PCR擴增，該方法特異性強，對豬源DNA檢測的靈敏度達到100 bp，可用于復雜食品樣本的檢測。劉建利等[7]模擬灌腸制作工藝，從摻入大量淀粉成分的豬肉灌腸中提取DNA然后設計特異性引物，進行PCR反應檢測其豬源性成分，結果顯示該方法用于豬肉灌腸豬源性成分檢測時可以檢測出模擬樣品中1%的豬源性成分。此方法的優點是方便、靈敏度高成本較低，缺點是只能定性檢測。PCR法具有靈敏度高和特異性強等優點，但PCR法在檢測過程中易出現假陽性、檢測時間較長，還需要獲得高濃度和純度的DNA才能得到可靠的結果，DNA提取的方法也會影響PCR方法的檢測結果。

1.2 限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應技術(RFLP)

RFLP-PCR是用PCR擴增目的DNA，然后對擴增產物進行酶切，最后直接在凝膠電泳上進行分辨。因為不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，所以產生不同長度的條帶，利用條帶大小的不同對豬源性成分進行檢測[8]。Kumar等[9]使用RFLP技術對線粒體細胞色素b基因，設計一對正向和反向引物(VPH-F和VPH-R)，用于擴增靶向物種的cytb基因的保守區域，產生609 bp PCR擴增子。使用Alu1和Taq1限制性酶對擴增子進行限制性內切酶消化，產生了一種能夠區分物種的獨特的消化模式，此方法可以對食品中豬源性成分進行檢測，優點是精確性和特異性高，缺點是檢測需要大約24 h。Riaz等[10]用RFLP技術在豬肉、牛肉和小麥粉的三元混合物中有選擇性地檢測到豬的DNA，檢測下線為0.000 1 ng。RFLP-PCR的優點是擴增替代了酶切，避免了RFLP繁瑣的DNA酶切、轉移、雜交等步驟。RFLP-PCR的缺點是不適用于對熟肉的檢測且檢測時間較長、成本高[11]。

1.3 實時定量熒光PCR(Real time PCR)

實時定量熒光PCR是將熒光基團加入到PCR反應體系中，然后利用熒光信號的累積對整個PCR的進程進行實時監測，最后通過標準曲線或Ct值對模板進行分析。Cai等[12]通過實時PCR對明膠產品中的豬源性和牛源性成分進行檢測和定量分析。Perestam等[13]采用實時PCR和ELISA法對含有已知百分比的豬肉和牛肉的15個參考樣品進行檢測，結果顯示，實時PCR能夠檢測出0.10%的豬肉和0.50%的雙組分混合物的牛肉。說明與ELISA相比實時PCR法是更可靠更便宜的辦法，但值得注意的是，此研究的結果是基于特定的方案進行的，其他的QPCR和ELISA方案可能會顯示不同的結果。Al-Kahtani等[14]用實時PCR檢測肉類混合物中的豬源性成分，采用豬肉DNA標準曲線和循環閾值(Ct)值進行量化，結果顯示混合物中豬肉DNA的檢測限分別為0.22，0.047，0.048，0.000 003 7，0.015 ng/μL。由于實時PCR比常規PCR的靈敏度高，所以檢測更加準確、可靠、靈敏。在肉類產品中如果檢測出含有低于0.1%的豬源性成分即可被認為是商業生產線中的交叉污染造成的，而不是故意摻假，因為如此低水平的摻假量在經濟上是不劃算的。Ali等[15]開發了一種Taq Man探針實時PCR檢測方法，利用豬細胞色素b基因作為模板進行擴增，對11種不同肉類和魚類的DNA進行特異性測試，結果表明，PCR效率(E)為93.8%，相關系數(R2)為0.991，檢測結果準確度為(100±0.01)%。實時PCR為深度加工的食品中豬源性成分的檢測提供了一種快速、靈敏、高度特異的方法[16-18]。

1.4 隨機擴增多態性DNA標記技術(RAPD)

隨機擴增多態性DNA標記技術(RAPD)是采用隨機合成的寡核苷酸作為PCR的引物，對所研究生物的基因組DNA進行PCR擴增，將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外下對條帶進行比較來區分物種的一種檢測方法。Martinez等[19]利用RAPD對幾種肉類產品進行檢測，利用RAPD法能夠成功鑒定出肉類的動物源性。Rastogi等[20]成功地應用RAPD技術識別蛇和水牛以及其他物種，目的基因是線粒體16S rDNA和NADH脫氫酶亞基4(ND4)基因和核肌動蛋白基因。RAPD是一種簡單而快速的豬源性檢測方法，所選用隨機引物不需要進一步放大基因片段的信息，操作簡便[21]。但是RAPD存在重復性差、需要高質量的DNA等缺點。這限制了其在高度加工肉類中的檢測靈敏度。由于PCR反應的非特異性，RAPD法不適用于鑒定混合肉類中的豬源性成分[22]。

2 基于蛋白質分析的檢測方法

2.1 免疫學法

ELISA又稱酶標法，是把已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，利用抗原抗體結合的專一性進行免疫反應的定性和定量的檢測方法。陳輝[23]采用了原核表達系統來獲得重組豬骨骼肌肌鈣蛋白I (TnI-fast)，分別制備了單克隆抗體和多克隆抗體，然后使用夾心ELISA法鑒別熟肉中豬源性成分。Yamamoto等[24]建立了靈敏度、重復性好的檢測牛肌紅蛋白的ELISA法。Kim等[25]研究了豬肉脂肪組織中熱穩定性可溶蛋白(TSSP)的提取和存在以及TSSP的抗原性。特別是基于PF 2B8-31 Mab的ELISA法，無需任何優化就能敏感地檢測出1%的豬源性成分。同時還可以從混合物中檢測到1%的豬源性成分。此項研究開發的MAbs可作為生物受體，用于開發免疫分析，以便于快速檢測食品中豬源性成分。Mandli等[26]開發了酶聯免疫傳感器，用于肉類中的豬源性成分的檢測，利用IgG在聚合物改性石墨電極上的電誘捕技術，開發了直接和競爭性2種電化學免疫傳感器模式，這2種模式分別能夠在2 h(生肉、熟肉靈敏度分別為0.1%，1.0%)和20 min(靈敏度為0.01%)內完成豬源性成分的檢測。ELISA法是目前基于蛋白質鑒定豬源性成分最好的方法，操作簡單且敏感性和特異性高，還能進行定量測定，可用于鑒定肉類中的任何物種。當然它也存在如蛋白質在熱處理下易變性，重復性不好等缺點。

2.2 雙向電泳(2-DE)

雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術是將等電聚膠和SDS-PAGE的結合起來，即先進行等電聚膠電泳(按照pI)分離，再進行SDS-PAGE(按照分子大小分離)。經過染色后得到二維分布的蛋白質電泳圖。Lametsch等[27]通過使用雙向凝膠電泳結合MALDI-TOF質譜法鑒定蛋白質斑點，成功檢測豬肌肉蛋白質。Montowska等[28]對生肉和加工后的產品檢測發現牛、豬、雞、火雞、鴨和鵝之間2-DE蛋白模式的種間差異。由于某些蛋白質在肉類老化過程中結構穩定且耐受熱加工，所以利用雙向電泳分析生肉，香腸等多種產品的蛋白質譜圖，可以成功地檢測食品中的豬源性成分。雙向電泳法的優點是對未處理的樣本耐受性好且條帶分辨率高。但是雙向電泳操作比較繁瑣且重復性差。所以使用雙向電泳進行蛋白質分析時就需要專門的技能和對該領域深入了解的特定的高技能人才[11]。

3 其他檢測方法

3.1 光譜分析

不同肉類產品的水、蛋白質、脂肪酸、脂類等基本成分含有特定化學鍵的官能團(O—H、C—H、N—H、C—O、氫鍵等)，紅外光譜對這些鍵進行照射會產生振動響應并將其記錄為光譜[29]。化學計量學從這些復雜的光譜中提取信息來進行定性和定量地識別不同的肉類種類[30]。Bilge等[31]利用肉品種之間元素組成的差異性使用激光誘導擊穿光譜技術(LIBS)來鑒別肉的種類，獲得LIBS光譜圖后利用化學計量法進行分析，牛肉中豬源性成分的測定系數(R2)和LOD值分別為0.994%和4.4%，此技術可以對深度加工的肉樣中豬源性成分進行定性和定量檢測。研究結果顯示此技術有很好的應用前景。為了使該方法能適用于大規模樣品的常規分析，還需要進一步改進。比如，用于LIBS試驗的肉類的脂肪提取和干燥過程中可以利用高功率光源或雙脈沖LIBS技術來進行。此項技術雖然存在一些缺陷，但LIBS技術可成功的用于豬肉、牛肉、雞肉的定性和定量分析，也可成為肉類加工企業質量控制實驗室的有用工具。毛曉婷等[32]用高光譜成像技術對豬肉和牛肉模型進行鑒定，使用人工神經網絡(ANN)和支持向量機(SVM)模式對豬肉和牛肉模型的識別率分別為97.5%和100%，結果表明，使用成像光譜儀可以實現對豬源性成分的快速、準確檢測。Garrido-Novell等[33]對歧視模型中異常像素作為判別每種物種的可能性進行了研究。然后構建偏最小二乘判別分析光譜和紋理模型，前者反應光譜信息，后者反應基于不同特征組的空間信息。最后，使用分類樹對光譜和紋理信息進行整合，來確定這些信息的聯合使用是否能夠準確地區分物種。研究結果表明，將光譜特征和外觀特征結合在一顆分類樹中，比使用PLSDA光譜模型的分類結果要好，可以達到92%的正確率。基于光譜分析的另一種檢測技術是傅里葉變換紅外(FTIR)光譜。通過計算機進行傅里葉變換然后將所得到的光譜用于分析鑒定。王毅虎等[34]將傅里葉變換紅外光譜(FTIR)與衰減全反射(ATR)聯用進行判別分析，建立了簡單、快速檢測明膠中的豬源性成分的方法。孟一等[35]利用傅里葉變換近紅外光譜技術建立豬肉的定性識別模型，用主成分分析法對食品中豬源性成分進行檢測。雖然光譜分析靈敏度高、選擇性好、受干擾性比較低，但進行試驗測定時所用儀器比較昂貴。并且對操作人員的技術要求較高，因此光譜分析對豬源性成分的檢測只適用于實驗室。

3.2 液相色譜和氣相色譜

液相二級質譜(LC-MS/MS)是將經過第一次質譜檢測的離子以某種方式碎裂后再進行質譜檢測，具有很高的精確度與分辨率。氣相色譜—質譜聯用儀(GC-MS)是把氣相色譜和質譜的特性結合起來檢測不同物質的方法。馬靈飛等[36]用氣相色譜法對大量的肉制品進行了檢測，使用保留時間和質譜法對36種脂肪酸的成分進行了檢測，可以對其中8 種脂肪酸的豬源性成分進行了鑒定。該方法具有操作簡單、檢測時間短、使用樣品量少等優點，在豬源性成分檢測中具有一定的前景。Sha等[37]使用高效液相色譜(HPLC)和線性離子阱(LTQ)/Orbitrap高分辨質譜聯用系統可以對明膠中豬源性成分進行精準檢測。HPLC-LTQ/Orbitrap高分辨率質譜技術是食品工業中對明膠產品進行質量控制的一種潛在技術。但是其他食物成分比如糖和油等就會干擾檢測結果。因此，只有改進液相色譜—高分辨率質譜法的識別方式，才能提高此技術對含有多種成分的食品檢測的精度。液相二級質譜的優點是精確度高、分離能力強和檢測限的范圍較廣泛，但它的缺點是對于沸點與溶劑相近的組分不能進行檢測，而且溶劑很難揮發完，本底效應高不利于后續分辨。氣相色譜(GC-MS)對化合物有很強的分離和鑒定能力，并且靈敏度極高，但是氣相色譜的缺點是儀器價格昂貴，前期樣品處理上會用到較多的有毒化學品，且購買手續麻煩。

3.3 電子鼻

電子鼻是由氣敏傳感器陣列、信號處理單元和模式識別單元三部分組成。檢測時，氣敏傳感器陣列將氣味分子吸附后產生信號，然后將信號傳遞到信號處理單元進行處理和加工，最后由模式識別單元對信號處理的結果做出綜合判斷后得出分析結果。Man等[38]使用電子鼻在RBD棕櫚油中檢測到豬源性成分。Nurjuliana等[39]用電子鼻檢測和區分了豬油、其他類型的動物脂肪和含豬油的樣品，結果以表面聲波(SAW)探測器頻率的氣味振幅極坐標圖來顯示，然后使用主成分分析(PCA)來分析數據，開發了快速檢測食品中豬源性成分的方法。田曉靜等[40]利用經典的pH值和顏色評價方法，結合電子鼻技術，建立了檢測肉餡中豬肉摻假的模型。采用特征提取方法收集樣本中揮發性化合物，利用主成分分析PCA、加載分析和逐步線性判別分析Step-LDA等方法獲得最優數據矩陣。采用BP-ANN、PLS和MLR建立了羊肉糜中豬肉量的估算模型，結果發現BP-ANN建立的模型可以比PLS和MLR更精確地預測摻假。電子鼻具有檢測速度快、樣品預處理簡便、響應時間短等優點。但是傳感陣列專屬性以及穩定性較差、容易受到環境因素的影響(如溫度、濕度、振動等)。所以在未來需要根據所測樣品針對性地開發特異性強、敏感度高的傳感器材料，并優化傳感器陣列從而使電子鼻能夠更好地對食品中豬源性成分或其他物種源成分進行檢測。

4 結論

實時PCR是目前基于DNA檢測食品中豬源性成分的最適方法。在實時PCR過程中，由于發射的熒光可以被自動測量并且與產物的量呈正比，所以可以直接對豬源性成分進行定量分析且靈敏度高。但同時存在DNA提取成本高、耗時長、DNA受熱易降解和會導致假陽性等缺點。這就需要后續研究對此方法進行改進，以創立一種更加快速、靈敏、高度特異且成本較低的方法。基于蛋白質的最適檢測方法是ELISA法，該法的操作簡便且敏感度和特異性高，所以可用于鑒定肉類中的任何物種。但在后續研究中需要克服蛋白質在熱處理下易變性、重復性不好等缺陷。光譜分析雖然靈敏度高、選擇性好、受干擾性比較低，但是進行試驗測定時使用的儀器比較昂貴，并且對人員的檢測技術和操作能力要求較高，所以光譜分析只適用于實驗室檢測。液相二級質譜具有精確度高、分離能力強和檢測范圍較廣泛等優點，但不適用分析復雜的成分。氣相色譜不但靈敏度極高，且分離能力和對未知化合物的鑒定能力很強，所以氣相色譜是目前分離和檢測復雜化合物最有力的檢測方法之一。電子鼻具有檢測靈敏度高，檢測速度快，檢測時間短等優點，所以未來在豬源性成分檢測中具有很大的發展空間。