遠志助眠功效成分提取及分析

陳麗歡 徐德平 孔佳美 姚明華 張 東 古麗拜克熱木 高靜秋

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

遠志又名細葉遠志，是可用于保健食品的中藥[1]，具有安神、祛痰、消腫等多種功效[2]。據報道[3]，遠志主要成分為皂苷，此外還包括糖、哐山酮類、香豆素等多類化合物。有研究[4-8]表明，生遠志高劑量能協同戊巴比妥鈉呈現明顯的催眠作用，同時也證明[9]中樞系統中，單胺類遞質如多巴胺、5-羥色胺等在睡眠調節中起著重要的作用。但未有關于遠志起助眠作用的具體物質以及作用機制的研究。

本試驗從遠志藥材的提取分離擬對遠志醇提物的不同萃取物助眠作用進行研究，并通過直接睡眠法和分析小鼠海馬區多巴胺含量的變化得到遠志助眠的功效物質；通過HPLC-MS和NMR對該物質進行結構鑒定，為遠志進一步開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

遠志：產地山西；

ICR 小鼠：18～22 g，南京模式動物研究所；

DA標準品：美國Sigma公司；

硅膠板：GF254，山東煙臺芝罘化工廠；

Octadecylsilyl(ODS)填料：北京綠百草科技發展有限公司；

Middle Chromatogram Isolated Gel( MCI )填料：三菱化學控股集團；

丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

甲醇、磷酸氫二鈉：色譜純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 試驗儀器

萃取罐：RAT-100 型，上海錦賦實驗儀器設備有限公司；

旋轉蒸發器：XHRE-1002型，廣州予華儀器有限公司；

攝像頭：LS-Q130W-1型，廣東東莞市盛鼎電子科技有限公司；

恒流泵：SYB106-100 型，天津市科器高新技術公司；

暗箱式紫外透射儀：ZF-90 型，上海顧村電光儀器廠；

可見分光光度計：V-5100B 型，上海元析儀器有限公司；

自動部分收集器：BS-160ABS-160A 型，上海金鵬分析儀器有限公司；

超聲波清洗器：FRQ-1002T 型，杭州法蘭特超聲波有限公司；

高效液相色譜儀(紫外+熒光檢測器)(反相)：1525型，美國沃特世公司；

液質聯用儀：MALDI SYNAPT MS 型，美國沃特世公司；

核磁共振儀：Avance 500 MHz型，美國Bruker 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理 將20 kg遠志粉碎，過30目篩后，放入體積為100 L的提取罐中，按料液比1∶10 (g/mL)加入75%的乙醇，60 ℃攪拌提取3 h，取上清液后，渣重復提取2次。將3次所得上清液濃縮后得遠志乙醇提取物。將乙醇提取物和去離子水1∶1 (g/mL)混合后，依次用相同體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取、濃縮后得石油醚萃取物(Ⅰ)、乙酸乙酯萃取物(Ⅱ)、正丁醇萃取物(Ⅲ)以及萃余物(Ⅳ)，于-18 ℃保存備用。

1.2.2 遠志醇提物不同溶劑萃取物的助眠作用 取50只ICR小鼠，10只/組，共5組，分別進行灌胃。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4組試驗小鼠的灌胃劑量均為1 g/kg·BW，對照組給等量生理鹽水，1次/d。1周后，觀察灌胃30 min內小鼠的睡眠率、灌胃結束后12 h內小鼠的睡眠時間。

1.2.3 乙酸乙酯萃取物的分離 將遠志醇提物的乙酸乙酯萃取物上MCI(5 cm×100 cm)柱，依次用不同體積分數的乙醇溶液(30%，50%，70%，95%)洗脫，通過薄層色譜法(TLC)檢測洗脫液中的成分，根據TLC檢測結果合并相同成分的洗脫液，分成A(30%洗脫)、B(50%洗脫)、C(70%洗脫)、D(95%洗脫)4個部分。將其分別減壓濃縮，于-18 ℃保存備用。

1.2.4 乙酸乙酯萃取物不同分離組分的助眠效果 取50只ICR小鼠，10只/組，共5組，分別給藥灌胃。A、B、C、D 4組小鼠的劑量為500 mg/kg·BW，對照組(CK)小鼠給等量生理鹽水，1次/d。1周后，觀察灌胃30 min內小鼠的睡眠率、灌胃結束后12 h內小鼠的睡眠時間。

1.2.5 測定腦組織多巴胺含量

(1) 制備勻漿：使用異弗烷麻醉小鼠后進行經心灌注。將小鼠斷頭處死，迅速剝取全腦，置冰盤中，分離出小鼠左、右海馬區，-80 ℃冰凍保存備用[9]。

稱取海馬區0.2 g，加入0.1 mol/L的高氯酸300 μL后置于冰盤上碾碎1 min。以15 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜后，進樣分析[10]。

(2) 色譜條件：根據文獻[11]修改如下，pH 3.0；流速1.0 mL/min；檢測波長280～320 nm；柱溫10 ℃；進樣量15 μL。

1.2.6 遠志助眠活性部位的成分分離 將1.2.4中助眠效果好的組分減壓濃縮后上樣到MCI 柱(5 cm× 100 cm)，依次用不同體積分數的乙醇洗脫，薄層色譜層析法檢測洗脫液中的成分，并根據結果將相同成分合并，濃縮后重復過MCI(5 cm×100 cm)柱，得到主要成分的較純化合物A。

1.2.7 遠志助眠活性部位的成分檢測

(1) 發泡性試驗：皂苷能降低水溶液表面張力，產生的泡沫不因加熱而消失[12]。取0.5 g化合物A，加水5 mL溶解，煮沸10 min后濾出水溶液。

(2) 氯仿-硫酸反應：取0.5 g樣品溶于氯仿，加入濃硫酸后分層，氯仿層呈紅色，硫酸層顯綠色熒光。通過上述現象則可判斷為皂苷。

(3) Lieberman-Burchard反應：將試樣溶于氯仿，加入濃硫酸-乙酐(1∶20)數滴，呈黃→紅→藍→紫→綠色的變化后，觀察最后的成色。

(4) 結構檢測：使用液質聯用儀(HPLC-MS)推斷樣品的結構成分。

HPLC-MS檢測條件：檢測波長200～400 nm；分析柱為BEHC18柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；流動相：0.1%甲酸洗脫40 min → 乙腈和0.1%甲酸混合液(體積比3∶7)洗脫45 min → 乙腈和0.1%甲酸混合液(體積比8∶2)洗脫50 min → 100%乙腈洗脫55 min → 0.1%甲酸洗脫35 min；柱溫45 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL。

(5) 核磁共振分析：以二甲基亞砜-d6(DMS-d6)為溶劑，四甲基硅烷(TMS)為內標物，將得到的化合物經氫譜和碳譜等光譜數據分析，確定其結構。

1.2.8 統計學方法 采用SPSS 22.0進行分析。組間差異比較采用單因素方差分析，P<0.05為有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 遠志醇提物的不同溶劑萃取物的助眠作用

由表1可知，在不同溶液的萃取物中，遠志乙酸乙酯萃取物的試驗小鼠睡眠率、睡眠時間均為最佳，助眠效果最顯著，且與空白小鼠存在顯著性差異(P<0.01)；遠志正丁醇萃取物試驗小鼠的睡眠時間與空白小鼠也有顯著性差異(P<0.05)，但明顯低于乙酸乙酯萃取物的小鼠睡眠時間。

試驗中遠志醇提物不同溶劑萃取物明顯延長各組小鼠睡眠時間和睡眠率的現象，與北五味子多糖[13]能夠顯著延長小鼠睡眠時間的現象一致，由此推斷遠志醇提物有助眠作用，且有效成分為遠志醇提物乙酸乙酯萃取物。

2.2 乙酸乙酯萃取物不同組分對小鼠的助眠作用

由表2可知，遠志醇提物乙酸乙酯萃取物MCI柱70%乙醇洗脫物的試驗小鼠的睡眠率最高，為80%，同時平均睡眠時間最長，為509.6 min，且明顯高于其他各組的，同時具有顯著性差異(P<0.05)。

表1 不同萃取物對小鼠睡眠率和時間的影響?Table 1 Influence of extracts on sleep rate and time of mice

? a. 與對照組相比在P<0.05水平差異顯著；b. 與對照組相比在P<0.01水平差異顯著。

? a. 與對照組相比在P<0.05水平差異顯著；b. 與對照組相比在P<0.01水平差異顯著。

分析圖1，組別為遠志醇提物乙酸乙酯萃取物MCI柱70%乙醇洗脫物的小鼠海馬區DA含量最高，與空白組相比效果最明顯(P<0.01)。組別為遠志醇提物乙酸乙酯萃取物MCI柱20%乙醇洗脫物、50%乙醇洗脫物、95%乙醇洗脫物的小鼠海馬區DA含量與空白組相比差異顯著(P<0.05)，明顯低于遠志醇提物乙酸乙酯萃取物MCI柱70%乙醇洗脫物的試驗組小鼠海馬區DA含量，同時具有顯著性差異(P<0.05)。

睡眠是中樞神經系統發生的一個主動過程，與腦內神經遞質，尤其是單胺類遞質，如多巴胺、五羥色胺的動態變化有著極大的關聯，DA作為中樞神經遞質中最重要的組成部分，在睡眠-覺醒過程中起著極其重要的作用[9, 14-16]。因此，組別為遠志醇提物乙酸乙酯萃取物MCI柱70%乙醇洗脫物的小鼠海馬區DA含量的顯著提高有利于該組小鼠睡眠率的提高、睡眠時間的延長，故推斷該部分為遠志助眠的功效部位。

a. 與空白對照組比較在P<0.05水平差異顯著；b. 與空白對照組比較在P<0.01水平差異顯著

圖1 不同組別小鼠海馬區中多巴胺(DA)的積分峰面積

圖1 The peak areas of dopamine in different groups of mouse hippocampus region

綜合表2和圖1可知，遠志醇提物乙酸乙酯萃取物中具有助眠作用的功效成分主要集中在MCI柱70%乙醇洗脫物中。

2.3 乙酸乙酯萃取物MCI柱70%乙醇洗脫部分成分純化及分析

2.3.1 遠志助眠活性成分的理化分析 70%乙醇洗脫部分具有很好的助眠作用，分離后得一個單體化合物A，其理化檢測結果見表3。

從表3可知，單體化合物A的各項理化檢測均呈現皂苷具有的性質，故推斷該化合物為皂苷類物質。

表3 各項檢測結果及其分析Table 3 Results and inferences of different physical tests and chemical analysis

2.3.2 HPLC-MS檢測 圖2為HPLC圖譜，圖3～5為主要化合物的質譜圖。

圖2中主要有3個峰，即該部分主要有3種化合物組成，含量最多的化合物保留時間為6.99 min(圖5)，其與保留時間為6.93 min(圖4)的化合物為同分異構體，對應的分子量均為1 573，由于分子量為奇數，可以推斷化合物含有氮。

2.3.3 核磁共振分析 化合物A的13C-NMR和135dept圖譜見圖6。從圖6中可以看出化合物A不純，結合HPLC-MS檢測可以看出該組分含有2個同分異構體，使用常規的色譜方法難以將其分離。但圖6(a)中可以看出在化學位移為20～60時，有明顯的皂苷信號，但為何種皂苷無法確定，同時也可看出在化學位移為60～105時有3個糖殘基，說明化合物含有1個由3個糖組成的糖鏈，其詳細結構還在繼續研究中。

圖2 MCI柱70%乙醇洗脫物液相色譜圖Figure 2 The chromatography of elution fraction of 70% ethanol in MCI in HPLC

圖3 保留時間為6.76 min化合物的質譜圖Figure 3 Mass spectrogram of the compound with the retention of 6.76 min

圖4 保留時間為6.93 min化合物的質譜圖Figure 4 Mass spectrogram of the compound with the retention of 6.93 min

圖5 保留時間為6.99 min化合物的質譜圖Figure 5 Mass spectrogram of the compound with the retention of 6.99 min

圖6 化合物A的13C-NMR和135dept圖譜Figure 6 13C-NMR spectrum and 135dept spectrum of A

3 結論

本試驗結果表明，遠志助眠功效部位為遠志醇提物乙酸乙酯萃取物MCI柱70%乙醇洗脫物；經分離純化后所得的較純化合物A為2個互為同分異構體的皂苷類物質，該物質分子量為1 573，且含有氮元素和1個由3個糖組成的糖鏈。本研究為遠志功能成分的開發提供了依據。但化合物A的具體結構仍需進一步研究。