大湘西野生獼猴桃釀酒酵母的分離鑒定及其產物ACE抑制活性

伍 強萬 常彭娟娟曾 豪余有貴

(1. 邵陽學院食品與化學工程學院，湖南 邵陽 422000；2. 邵陽市釀酒工程技術研究中心，湖南 邵陽 422000)

獼猴桃果酒除含一定乙醇外，還富含各種氨基酸、肽類及糖類、VC等成分，具有預防心腦血管疾病、抗氧化、抗菌消炎等保健功效[1]，但該功效究竟與哪些活性成分有關，目前尚未得到表征。

ACE抑制肽是一類具潛在降血壓功效的小分子物質，具備安全高效、人體易吸收等優點。關于食物中本身存在的天然ACE抑制肽研究甚少，通常采用定向酶解技術制備食源性小肽[2]。目前，已有研究發現利用微生物制成的發酵產品中含有活性較強的天然ACE抑制肽，其中Kleekayai等[3]發現經傳統自然發酵法制成的泰國蝦醬中含有2種ACE抑制肽(Ser-Val和Ile-Phe)；Wang等[4]利用納豆芽孢桿菌發酵豆粕獲得ACE抑制肽，測得其活性IC50為22 μg/mL；Nejati等[5]接種乳酸乳球菌DIBCA2制成發酵乳，獲得IC50為5 μg/mL 的ACE抑制肽；Wang等[6]發現經霉菌發酵生產的豆豉中富含ACE抑制肽，并指出霉菌發酵過程中發生的美拉德反應影響ACE抑制活性，目前國內外尚未見果酒ACE抑制肽的研究報道。

本研究擬以大湘西野生獼猴桃為菌種分離源，通過分離篩選和分子生物學鑒定，旨在獲得一株適用于獼猴桃果酒發酵的優勢野生酵母菌，并初步研究該菌株純種發酵過程中ACE抑制活性、多肽濃度及酒精度的動態變化，為開發大湘西野生獼猴桃降血壓型保健果酒提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

酵母菌分離源：湖南邵陽綏寧野生獼猴桃；

對照菌株：安琪果酒酵母，安琪酵母股份有限公司；

酵母26S rRNA基因D1/D2區序列擴增引物NL-1(5＇-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3＇)、NL-4(5＇-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3＇)：北京六合華大基因有限公司；

CTAB、TE、蛋白酶K、PCR緩沖液、dNTP、TaqDNA聚合酶：北京寶杰羅生物科技有限公司；

果膠酶：酶活50 000 U/g，河南華悅化工產品有限公司；

培養基所有試劑均為分析純。

1.2 培養基

分離培養基：YEPD培養基[7]；

WL培養基：葡萄糖50 g，溴甲酚綠0.022 g，磷酸二氫鉀0.55 g，胰蛋白胨5.0 g，氯化鉀0.425 g，酵母浸粉4.0 g，硫酸鎂0.125 g，硫酸錳0.002 5 g，氯化鐵0.002 5 g，氯化鈣0.125 g，瓊脂20.0 g，用蒸餾水定容至1 L，pH為6.5，高溫121 ℃滅菌20 min[8]；

獼猴桃培養基：選八成熟、發軟的野生獼猴桃，清洗干凈，打漿，加入0.10 g/100 g果膠酶攪拌均勻，在35 ℃酶解3 h，取上清液于68 ℃滅菌20 min。

1.3 主要儀器設備

單人單面垂直凈化工作臺：SW-CJ-1FD型，蘇州博萊爾凈化設備有限公司；

數碼顯微鏡：BA310型，麥克奧迪(廈門)實業集團有限公司；

打漿機：JYL-C012型，九陽股份有限公司；

pH計：EL20型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-1780型，日本島津儀器有限公司；

高壓滅菌鍋：JI54DWS型，致微(廈門)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 酵母菌的分離 根據柴洋洋等[9]的方法修改如下：無菌稱取10 g新鮮的野生獼猴桃，置于無菌研缽中研成果漿，轉移至裝有90 mL無菌水的三角瓶，混合均勻后置于28 ℃ 培養24 h。以無菌水對該漿液進行梯度稀釋，吸取10-1稀釋液2 μL涂布于YEPD分離培養基上，于28 ℃培養3 d。挑選典型的酵母單菌落平板劃線，繼代2次獲得純化菌種，用JM1、JM2、JM3、……依次編號，觀察菌落形態特征。

1.4.2 釀酒酵母的篩選 挑選YEPD分離培養基上具有單菌落、表面光滑突起、呈奶油色的菌株，在10×80倍顯微鏡下鏡檢，觀察細胞的形態特征，對多端出芽繁殖的酵母菌株進行初篩。

采用WL培養基從初篩的酵母菌株中篩選出釀酒酵母[8]，將酵母菌株分別劃線接種于WL培養基，28 ℃培養5 d 后，選擇顏色為乳白色、球形突起、表面光滑不透明、平板上有酒香的菌株。

將篩選的釀酒酵母活化后，以3 mL/100 mL接種量(種子液濃度1.0×108個/mL)接種于獼猴桃培養基上，調整起始pH為3.6，起始糖度160 g/L，于28 ℃發酵72 h，測定發酵醪液的ACE抑制活性及酒精度，以安琪果酒酵母作為對照，篩選出發酵能力較強并具有ACE抑制活性的釀酒酵母。

1.4.3 酵母菌的分子生物學鑒定 根據牛廣財等[10]的方法修改如下：取純化菌株于研缽中液氮研磨，加入600 μL TE充分懸浮菌體，加入10% SDS 250 μL，倒轉混勻后加入20 ng/μL 蛋白酶K 3 μL，于37 ℃水浴1 h。依次加入5 mol/L NaCl 150 μL、2% CTAB 150 μL，于65 ℃水浴20 min。12 000 r/min離心20 min，取上清液加入等體積異丙醇，放置30 min。12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取沉淀加入70%酒精750 μL，充分懸浮后12 000 r/min、4 ℃離心2 min，取沉淀加入30 μL(含Rnase，10 ng/μL)，4 ℃溶解過夜。PCR擴增條件：95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min。反應體系(30 μL)：Taq聚合酶(5 U/L)0.2 μL，PCR緩沖液3 μL，dNTP混合液(25 mmol/L)2 μL，引物NL-1(10 mol/L)3 μL，引物NL-4(10 mol/L)3 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O定容至30 μL。將PCR產物送至北京六合華大基因有限公司進行26S rDNA D1/D2測序，在GenBank核酸序列數據庫中進行同源序列比對(BLAST)。

1.4.4 發酵醪液的ACE抑制活性 將分離篩選獲得的釀酒酵母接種于獼猴桃培養基，調整起始糖度為160 g/L，起始pH為3.6，在28 ℃下進行純種發酵。分別在不同發酵階段(0，2，4，6，8，10 d)取100 mL發酵醪液，根據余有貴等[11]的方法，采用密度儀測定其酒精度。4 000 r/min離心15 min，測定發酵醪液上清液的ACE抑制率和多肽濃度。

1.4.5 ACE抑制率的測定 參照Wu等[12]的方法。

1.4.6 多肽濃度的測定 根據Wu等[13]的方法修改如下：將發酵醪液上清液與10 g/100 mL的三氯乙酸(TCA)水溶液等體積混合后靜置10 min，在4 000 r/min下離心15 min，取上清液用福林—酚法測定吸光值，計算多肽濃度。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的分離純化與篩選

經初步分離，獲得12株符合條件的酵母菌菌株，分別標記為JM1～JM12。如表1所示，通過菌落形態觀察和細胞形態鏡檢，發現JM1、JM2、JM3、JM4、JM5、JM6、JM11、JM12菌落均呈白色，顯微鏡下觀察細胞多呈圓形、橢圓形，其中JM1、JM11、JM12菌落較大、呈奶白色、表面光滑突起[圖1(a)]，細胞呈圓形[圖1(b)]。利用WL培養基對8株菌株作進一步篩選，發現其菌落形態差異明顯，JM1、JM11、JM12菌落呈乳白色、球形突起、表面光滑不透明[圖1(c)]，平板上有酒香，將其初步擬定為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；JM2、JM3菌落中央呈深綠色、邊緣呈淡綠色，扁平、表面光滑不透明，呈黃油狀，屬于葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)；JM4、JM5、JM6菌落呈鮮綠色，菌落很小、表面光滑不透明、呈黃油狀，屬于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyccspombe)。

表1 野生獼猴桃酵母菌的分離篩選Table 1 Isolation and screening of yeast strains from wild kiwifruit

圖1 野生獼猴桃釀酒酵母菌JM11的形態特征

圖1 Morphological characteristics ofSaccharomycescerevisiaeJM11 from wild kiwifruit

選取JM1、JM11、JM12對獼猴桃培養基進行發酵，比較三者的產酒量及ACE抑制活性，發現JM11發酵醪液的酒精度最高(5.6%Vol)，ACE抑制率較強(69.4%)。對JM11作進一步分子生物學鑒定，以驗證該野生酵母菌為釀酒酵母。

2.2 釀酒酵母的分子生物學鑒定

利用引物NL-1與NL-4對該釀酒酵母26S rDNA基因序列進行PCR擴增，如圖2所示，瓊脂糖凝膠電泳顯示該擴增產物的分子量約為550 bp。

野生獼猴桃酵母菌JM11的DNA測序結果如圖3所示，將該序列提交至GenBank核酸序列數據庫進行序列比對，發現該菌株與Saccharomycescerevisiae(MG547774.1)序列相似性最高，為90%。結合該菌株的YEPD培養基、WL培養基等菌落特征和顯微鏡細胞形態觀察，確定所篩選的野生獼猴桃酵母菌JM11屬于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

M. 標準Maker JM11. PCR產物圖2 野生獼猴桃釀酒酵母菌JM11的PCR產物電泳圖

圖2 Electrophoretogram of PCR product ofSaccharomycescerevisiaeJM11 from wild kiwifruit

2.3 釀酒酵母發酵醪液的ACE抑制活性

如圖4所示，隨著野生獼猴桃釀酒酵母純種發酵的進行，該發酵醪液中多肽濃度呈先上升后下降的趨勢，ACE抑制率則先上升后趨于平緩。酒精度不斷上升，盡管在第6天時酒精度高達9.5%Vol，但在發酵第4天時，ACE抑制率由發酵前的32.6%上升至93.0%，多肽濃度也達到最高值(2 652.0 μg/mL)，說明在野生獼猴桃經自然發酵后產生了活性較強的ACE抑制劑，其活性高于箭魚魚卵[14]、墨魚[15]、鴨皮[16]等食源性ACE抑制劑。

真菌在生長過程中可分泌蛋白酶，將蛋白質降解為氨基酸或短肽[17]。酵母為適應環境變化，胞內會出現應激蛋白，與此同時也會分泌胞外蛋白作為一種信號載體或分泌蛋白酶來應對環境的變化[18]，釀酒酵母[19]和純生啤酒酵母[20]在特定發酵條件下可分泌蛋白酶A酶原、蛋白酶A。因此，本研究推測在該發酵過程中野生酵母菌分泌蛋白酶，降解獼猴桃果肉蛋白，從而產生ACE抑制活性較強的肽類物質。為證實推測，后期課題組將進一步對發酵醪液中可能存在的ACE抑制肽進行分離純化，并研究該活性肽在野生獼猴桃純種發酵過程中的形成機理。

圖3 野生獼猴桃酵母菌JM11基因序列Figure 3 Nucleotide sequence of yeas JM11 from kiwifruit

圖4 野生獼猴桃不同發酵階段醪液中ACE抑制活性的測定

圖4 Determination of ACE inhibitory activity of wine fermentation liquor of wild kiwifruit

3 結論

利用平板劃線、YEPD培養基、WL培養基及顯微鏡觀察對野生獼猴桃酵母菌進行分離篩選及初步鑒定，發現野生獼猴桃酵母菌共有釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)、路氏類酵母(Saccharomycordesludwoggi)、紅酵母(Rhodotorular)、全美梅氏酵母(Metschnicowiapulcherrima)5類，分別編號為JM1～JM12，其中JM1、JM11、JM12被鑒定為釀酒酵母。利用ACE抑制活性、酒精度等指標對酵母菌JM1、JM11、JM12作進一步篩選，發現JM11發酵醪液表現出較強的ACE抑制活性，并測得酒精度為5.6%Vol，經26S rDNA D1/D2區序列分析，確定野生獼猴桃酵母菌JM11為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。利用酵母菌JM11對野生獼猴桃進行純種發酵，發現該發酵過程中產生了活性較強的ACE抑制劑，該物質是否為ACE抑制肽，仍有待進一步確認。