葉綠素儀在河南平原煙區烤煙上的應用

王典　吳照輝　郭芳陽

摘要：為了研究SPAD-502葉綠素儀在河南平原煙區烤煙葉片上的應用方法，選取河南許昌煙區主栽品種中煙100和豫煙系列新品種豫煙9號作為試驗材料進行研究。結果顯示，在一天中隨著光照度的變化，兩個烤煙品種葉片的SPAD值也有相應的變化。綜合考慮測量的穩定性和可操作性等因素，上午8：00-10：00是測定的最佳時間段。用酒精棉擦拭測點和SPAD儀測試窗口，發現清潔后測得的結果有顯著變化。分別在團棵期、旺長期和成熟期等煙葉生長發育期內對兩個烤煙品種不同葉位的SPAD值進行分析發現，頂部完全展開葉的第3片葉測定結果相較于其他葉位變異系數較低，測定結果穩定；將頂3葉葉面分為10個測定位點進行分析發現，主脈中部左右兩側位點均值的變異系數和代表系數都較低，結果的穩定性和代表性為最優。

關鍵詞：SPAD葉綠素儀；烤煙；河南平原煙區

中圖分類號：S572；Q945.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）03-0051-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.03.013

Abstract： In order to study the method of SPAD-502 chlorophyll meter application in flue-cured tobacco of Henan plain tobacco region，the field experiment was conducted and choose two varieties Zhongyan 100 and Yuyan No.9 as materials. Results showed that，the leaf SPAD value of two varieties has certain change with the change of light intensity in one day. To comprehensively consider the factors such as stability and maneuverability of measurement，8：00 AM to 10：00 AM is the best determination period. After alcohol-tempon to clean site and test window，the measured results had significant changes compared with before. The leaf SPAD value of two varieties in different sites such as resettling period， vigorous growing period and mature period were analyzed，and it was found that，compared with the other leaves，the determination results variation coefficient of the top fully expanded third leaf was low，so the determination results had better stability；Dividing the top of the third leaf into 10 loci and it was found that the variation coefficient and representation coefficient of mean value of the main central vein left and right sides were low，so the results of the stability and the representative were the best.

Key words： SPAD chlorophyll meter； flue-cured tobacco； Henan plain tobacco region

植物全氮可以很好地反映植物的氮營養狀況，并且與作物產量也有較好的相關性[1]，因此植物全氮是一個很好的診斷指標。在烤煙整個生育期內，煙株生長和生理代謝都對氮素十分敏感[2]。然而在中國烤煙生產中存在著過量或過遲施氮的問題，這不僅增加生產成本、降低煙葉產質量，還因為肥料利用率較低引起環境污染[3]。河南作為濃香型煙葉最重要的產區，近年來備受品種的困擾，而外引品種并不能充分彰顯本地區的生態優勢，本地選育品種具有抗病性強、農田長勢良好和濃香型質量風格突出的特點，但耐肥性差、適宜的氮水平范圍狹窄，生產中往往由于施肥的問題不能充分彰顯品種特性。

傳統上多憑借土壤肥力、前茬和煙株的外在特征來調控煙株的營養和判斷煙株氮素的豐缺，但往往不夠精準或調控出現偏差，而利用測定煙株全氮的方法不僅破壞植株，同時化驗周期長、操作麻煩，難以實現作物生長期間的實時監測。因此，實時快速地監測田間煙株的氮素營養狀況，進而指導田間烤煙施肥，對于提高氮肥利用效率和煙葉的產量與質量意義重大。氮素是葉綠素的主要組成物質[4]，利用葉綠素儀獲得的植株葉片SPAD值（葉綠素的相對含量）與植株氮營養狀況具有良好的相關性[5]，并且在檢測植株葉片時有快速、簡便、無損的特點，便于人們及時采取營養干預和農藝措施來調整作物的生長發育，因此受到廣大植物營養學家的青睞，被廣泛應用在水稻、小麥、棉花、油菜等大農作物上。陳曉群等[6]利用SPAD值提出了基于水稻不同生育期葉綠素診斷值的氮肥推薦施用量。胡昊等[7]研究發現SPAD值可以進行葉綠素的診斷，并且通過SPAD值可以對冬小麥進行估產。關于烤煙方面的研究也有一些報道，王維等[3]研究發現利用葉綠素儀進行實時氮肥管理，獲得了較高的煙葉產質量，煙葉的化學成分更加協調。賀廣生等[8]研究發現烤煙K326品種在氮肥實時管理模式下的SPAD閾值40.5～43.0內（氮肥用量為75～110 kg/hm2）能獲得較高的煙葉產量、產值和氮肥利用率。

然而，葉綠素在植物葉片中的分布會因物種、測定時期、測定位置的不同而不同，因此SPAD儀測出的結果也不盡相同。柯嫻氡等[9]利用SPAD-502葉綠素儀對中國南方4種木本植物葉綠素相對含量進行測定發現，不同物種、不同葉齡、同一葉片不同部位、主脈左右兩側等因素都會對測定結果產生影響。陳琴等[4]測定5種牧草葉片上不同部位的SPAD值得出同一葉片上葉尖部>葉中部>葉基部的特點，葉中部的值穩定且更接近平均值，是最佳測定部位。煙草葉片在成熟期葉長能達到60～72 cm，葉寬30～40 cm，葉片數達到18～23片。煙草葉片寬大及葉片數多的特點，導致葉綠素含量分布有差異，選擇哪片葉、同一葉片的測定部位以及測定時間等都需要進行綜合考量，才能確定最能代表該煙葉的葉綠素相對含量的部位，目前關于SPAD葉綠素儀在河南平原煙區煙葉上的使用方法還沒有系統研究，針對河南平原煙區主栽品種的研究更少。為此，試驗選擇河南主栽品種為研究材料，利用SPAD-502葉綠素儀測定兩個品種在一天中不同時間點、不同生育時期不同葉位、是否用酒精清洗葉片和測試窗口等的SPAD值，確定兩個品種適宜的SPAD值測定位置，以期建立SPAD-502葉綠素儀在河南平原煙區的應用方法體系，為評價河南平原煙區烤煙煙葉的生長性能和營養狀況提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗在河南省農業科學院煙草研究所實驗地進行，供試土壤為潮褐土。供試品種是河南省主栽品種中煙100和河南省推廣應用的豫煙系列新品種豫煙9號。試驗肥料用量為兩個品種的習慣施肥水平：中煙100的氮肥用量為施純氮67.5 kg/hm2，豫煙9號的氮肥用量為施純氮45 kg/hm2，N∶P2O5∶K2O=1∶1.5∶3，試驗所用肥料為硝酸磷銨、過磷酸鈣、硫酸鉀。試驗小區長23 m，寬1.2 m，每個處理4行，每個處理面積110.4 m2。

1.2 測定項目和方法

1）測定時間。在煙葉旺長期的某一晴朗天氣（此階段是煙葉生長發育最快時期，煙葉的光合作用最強），每個品種選擇長勢一致的煙株5株，固定某一葉位（頂3葉），從6：00到19：00，每隔1 h測定兩個品種葉片的SPAD值，并繪制成曲線；同時用照度儀測定一天中不同時段的光強并繪制成曲線。

2）葉位和位點的選擇。分別在煙葉生長的團棵期、旺長期和成熟期，每個品種選擇長勢一致的煙株5株，用SPAD-502葉綠素儀測定每株頂部3片葉片的中部，每片葉測定4次，取其平均值作為該葉片的SPAD值。分別在煙葉生長團棵期、旺長期和成熟期選擇長勢一致的煙株5株，將頂部第3片葉片沿煙葉邊緣（SPAD-502葉綠素儀測試窗口能測到的最深位置）分成A、B、C、D、E、F、G、H、J、K等10個測量點（圖1），測定各個位點的SPAD值，每個位點測定4次，取平均值作為此位點的SPAD值。由于葉脈對SPAD-502葉綠素儀的讀數有影響，因此，測量時應避開葉脈集中的部位，以減小測量誤差。

3）參數計算。烤煙葉片相對較大，同一葉片不同位置的SPAD值不同，魚歡等[10]認為要通過綜合葉片SPAD值的代表系數和變異系數來確定能代表葉片葉綠素水平的SPAD值。代表系數由所測位點的SPAD值與整個葉片各位點平均值差值的絕對值表示，代表系數越小表示所測SPAD值越能代表該葉片的真實值；變異系數則是由各位點所測SPAD值的標準差與該位點的平均值的比值表示，變異系數越小，說明該位點的SPAD值越穩定。

計算方法：代表系數=│測定位點SPAD值-平均值│，變異系數=測定位點SPAD值的標準差/平均值。

1.3 數據處理

應用Excel 2010進行數據匯總及初步處理，采用Origin 9.0繪制圖表，采用SPSS 20.0統計軟件進行5%水平的差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 測定時間對煙葉SPAD值的影響

從圖2a可得，一天中從6：00到19：00的光強呈拋物線變化趨勢，即先升高后降低，中午從11：00開始光強急劇加強，12：00-13：00光強最強，14：00后光強逐漸下降，但仍處于較強的光照。在8：00-10：00、12：00-14：00兩個階段，兩個品種煙葉的SPAD值處于較穩定階段（圖2b），其他時段SPAD值的波動較大，這兩個階段是利用SPAD儀進行測定的最佳時段。綜合考慮，12：00-14：00是一天中光強最強的時間，此時田間溫度最高，不宜于進行大田測定，而8：00-10：00光強較弱，溫度相對較低，SPAD測定值較穩定，是大田測定SPAD值的理想時間。

2.2 葉位的選擇對煙葉SPAD值的影響

從表1可知，團棵期，兩個品種頂部3片葉的SPAD值沒有顯著變化，中煙100頂1葉和頂3葉的變異系數較低，豫煙9號頂部3片葉中變異系數較低的是頂3葉；旺長期，兩個品種頂部3片葉子的SPAD值從上到下依次升高，中煙100頂2葉和頂3葉的變異系數較低，而豫煙9號頂部3片葉子中變異系數最低的是頂3葉，為0.02；而在成熟期，中煙100頂部3片葉的SPAD值沒有顯著變化，其中頂3葉的變異系數最低，豫煙9號頂部3片葉的SPAD值依次呈現不顯著的降低趨勢，而頂1葉和頂3葉的SPAD值相對較低。綜合不同時期的比較結果，頂部完全展開葉的第3片葉是測定SPAD值的最佳葉位。

2.3 位點的選擇對煙葉SPAD值的影響

烤煙葉片上10個測量位點的劃分見圖1。由表2可知，團棵期，中煙100頂3葉SPAD值代表系數較小的位點在（C+H）/2、（B+G）/2，即葉片中部和中部靠基部的位置；旺長期，中煙100頂3葉各個位點中SPAD值代表系數較低的位點為（B+G）/2、（C+H）/2、（D+J）/2，即葉片的中部位置；煙株進入成熟期后，頂3葉上代表系數較低的位點為B、C、J、K。從這3個時期可知，葉中部的SPAD值代表系數較低，與整個葉片的平均值最接近，最能代表葉片的SPAD值。3個時期頂3葉各位點的SPAD值沒有顯著變化，但這3個時期中（C+H）/2位點的SPAD值變異系數均為最小值，說明這個位點測定的SPAD值最穩定。綜上，中煙100在團棵期、旺長期和成熟期均表現在葉片中部測定的SPAD值代表系數最低，數值相對穩定，因此測定中煙100的葉片SPAD值的最適位置是頂3葉中部葉脈兩側的均值。

由表3可知，豫煙9號在團棵期階段頂3葉各位點SPAD值的代表系數較低的位點有C、H、（B+G）/2、（C+H）/2，且代表系數較高的位點有E和K，說明靠近葉尖部的SPAD代表系數較大不適宜作為測定位點；旺長期時，10個基本位點中C、D、K代表系數較低，均值點中（C+H）/2、（E+K）/2代表系數較低；煙株進入成熟期后，代表系數較低的位點有J、（B+G）/2、（C+H）/2、（D+J）/2，基本都在葉片中部位置。綜上可知，3個時期中，豫煙9號頂3葉中部葉脈兩側均值（C+H）/2的代表系數最小，是最適合的測定部位。在團棵期和旺長期，頂3葉各位點的SPAD值沒有顯著區別，進入成熟期，由于葉片成熟落黃，葉尖部的SPAD值明顯低于其他部位。并且，這3個時期中（C+H）/2位點的變異系數均相對較小，說明這個位點獲得的SPAD值較穩定。綜上所述，豫煙9號在各個時期最能代表煙株葉片SPAD值的位點為頂3葉中部葉脈兩側的均值。

因此，最佳測定部位是葉片中部兩側。頂3葉中部葉脈兩側SPAD值的均值最能代表煙株葉片的SPAD值。

2.4 酒精處理葉片對SPAD值的影響

中煙100移栽后25 d（圖3a），經過酒精擦拭后，葉片的SPAD值與未處理相比變化趨勢一致，方差分析結果表明，經過酒精擦拭的葉片SPAD值呈現顯著降低；移栽后70 d（圖3b），經過酒精處理后同樣出現了顯著降低，但酒精擦拭前后的變化值小于移栽后25 d。同樣的，酒精擦拭對豫煙9號葉片的SPAD值有顯著影響（圖3c、3d）。因此，在測定煙葉葉片SPAD值時，需要用酒精棉對測點和測試窗口進行擦拭，然后再進行測定。

3 小結與討論

3.1 測量點和時間的選擇

試驗結果表明，中煙100和豫煙9號各個生育期用SPAD葉綠素儀診斷氮素營養時，時間上選擇一天中的8：00-10：00，選擇頂部完全展開葉的第3片葉子，主脈中部兩側每個位點測定4次，取其平均值作為該葉片的SPAD值。測定時要用酒精棉將測定位點和測試窗口擦拭干凈。

SPAD儀主要用于營養快速診斷、葉綠素含量預測、氮素含量監測等方面，研究手段多樣，研究結果也不盡相同。李鵬程等[11]發現棉花早熟品種主莖葉全生育期SPAD值呈現倒1葉<倒2葉<倒3葉<倒4葉的規律，而中熟品種在盛鈴期以前主莖4片葉SPAD值也呈現和早熟品種相同的規律，但盛鈴期以后SPAD值葉序變化不規則。有研究認為水稻葉片上距離葉基部1/2處的SPAD值穩定，是合適的測定位點[12]；但也有研究認為最佳的測定位點為距離葉基部2/3處[13]。在棉花上，有的選擇功能葉的底部、中部、基部，也有的在功能葉上均勻地測定5個點，求得平均值代表這個葉片的SPAD值水平[14]。徐照麗等[15]在云南省的田間試驗得出葉綠素儀在烤煙上的最佳測量部位為葉片基部；而李佛琳等[16]分析了煙株葉位和葉片部位的葉綠素計值發現葉綠素計測定煙葉時葉片各個部位均可選擇，但從穩定性和可操作性考慮，烤煙最佳測定部位為完全展開葉的中部。王維等[3]的研究結果表明，頂3葉的葉中位置SPAD值與葉片葉綠素含量、總氮含量的相關性最好，且變異系數小，是較為理想的指示葉或參照葉。本研究參考魚歡等[10]對胡椒葉片SPAD值的研究，煙葉SPAD值的測量部位需要考慮葉片SPAD值代表性和穩定性，由于煙葉葉片的特殊性，還需要考慮葉位和位點的選擇。中煙100在團棵期、旺長期和成熟期3個時期頂部第3片葉的變異系數較低，說明測得的SPAD值最穩定，因此中煙100測定SPAD值的最佳葉位應選擇頂部第3片葉。豫煙9號得出同樣的結果。綜上，中煙100和豫煙9號測定SPAD值在葉位上應選擇頂部第3片葉。葉位選擇上，由于煙葉面積大，不同部位植物葉肉組織成熟程度不同植物光生態情況不同[4]，所測SPAD值結果不同，因此將煙葉葉片按照主脈對稱沿葉邊緣（SPAD-502儀測試窗口能測到的最深位置）分為10個測量點，結果顯示，中煙100和豫煙9號在團棵期、旺長期和成熟期頂3葉SPAD值代表系數較小的位點均在葉片中部位置，說明葉片中部所測的SPAD值與平均值最接近，此位置最具有代表性。變異系數代表所測位點SPAD值的穩定性，比較各個位點的變異系數發現，兩個品種在各生長時期的變異系數相對其他位點都較低，綜合考慮各位置讀數的穩定性及其代表性，葉片中部的SPAD值與整個葉片各位置SPAD值的平均水平最接近，最能代表該葉的平均水平。因此綜合各位點測定結果的穩定性和代表性發現，煙葉頂部第3片葉的中部位置是最佳的測量位點，主脈中部兩側SPAD值的平均值更能代表整個葉片的SPAD值水平。

SPAD值取決于葉片葉綠素對特定波段光線的吸收，在同一天中，隨著光輻射照度的增強，測得的SPAD值會有降低趨勢。本文研究了兩個品種在一天中隨著光輻射變化葉片SPAD值的變化趨勢，發現一天中隨著光照幅度增加，SPAD值出現降低趨勢，這與陳防等[17]的研究結果一致。并且發現在8：00-10：00和12：00-14：00這兩個時間段內測得的SPAD值比較穩定，綜合考慮大田測量的可操作性、代表性等因素，選擇8：00-10：00進行大田煙葉SPAD值的測定。

3.2 葉片清潔度

烤煙葉片清潔度對SPAD值測定結果的影響未見有相關報道。本研究發現，中煙100和豫煙9號兩個品種葉片經酒精擦拭后，葉片的SPAD值出現顯著的變化。生育前期（移栽后25 d）酒精擦拭葉片和測定窗口后SPAD值變化顯著且幅度較大，生育中后期（移栽后70 d）葉片清潔后的SPAD值測定結果變化較小，整體趨勢基本保持一致。其原因可能為煙葉葉片表面分布著大量的腺毛，葉片從幼葉到進入生理成熟期，葉片黏性物質分泌增多[18]，而分泌物對葉片表面具有覆蓋作用，尤其在生育前期測量易受到農事操作和氣候的影響，葉面往往附著物較多，因此煙葉葉片表面需經過酒精擦拭，剔除其他外界雜質獲得的值更能代表葉片的真實值，所以在實踐應用中，應使用酒精棉簽擦拭測定窗口，如一次測量數據數較少可不擦。

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