冠心病患者固醇調節元件結合蛋白-1與核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白1炎性體相關性研究

徐健強，王燕，盤艷君，喻思揚，曾高峰，趙國軍

冠心病發病主要病理基礎是動脈粥樣硬化（AS）。AS發病機制極其復雜，與脂質代謝紊亂、炎癥反應激活及內皮細胞功能失調等多因素相關[1-3]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白1（NLRP1）炎性體由NLRP1、半胱天冬酶（Caspase）-1及凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）三者組成。炎性體相當于一個活化Caspase-1的支架，活化的Caspase-1能夠誘導白細胞介素-1β（IL-1β）及IL-18成熟[2,4]，參與多種炎癥性疾病的病理進程[5]。本課題組前期研究發現，抑制固醇調節元件結合蛋白-1（SREBP-1）后，人急性單核細胞白血病（THP-1）巨噬細胞中NLRP1、IL-1β和IL-18表達均顯著下降[6,7]，提示SREBP-1可能通過調控NLRP1炎性體參與冠心病進程。本研究觀察冠心病患者外周血單個核細胞（PBMCs）SREBP-1與NLRP1炎性體的表達情況，進一步探討二者之間的相關性。

1　資料與方法

對象：選取2015-07至2016-01體檢中心20名健康志愿者（正常對照組）。選取同時間段內在本院行冠狀動脈造影確診冠心病患者104例（有1支及以上主要血管狹窄≥50%），其中穩定性心絞痛49例（SAP組）和急性冠狀動脈綜合征55例（ACS組），急性冠狀動脈綜合征包含不穩定型心絞痛（初發心絞痛、靜息型心絞痛和勞力惡化型心絞痛）和急性心肌梗死。排除標準：肝功能異常；出現橫紋肌溶解；合并腫瘤；合并腎功能不全且失代償（血清肌酐濃度 ＞ 165 μmol/L，或血清肌酐清除率 ＜ 30 ml/min）；合并妊娠；嚴重心功能不全[紐約心臟協會（NYHA）心功能分級 ≥ 3級，或左心室射血分數 ＜ 35%）]；1個月內心肺復蘇術病史；近3個月有重大外傷、手術史；1個月內使用他汀、抗生素、阿司匹林等影響炎性因子表達者；明顯影響血流動力學的二尖瓣、主動脈瓣狹窄或關閉不全；合并急、慢性感染者；持續或頻發室性心動過速，心室顫動患者。

方法：采血前禁煙、酒、茶、咖啡等24小時以上。次日清晨使用25 IU/ml肝素抗凝管，空腹肘靜脈采血10 ml， 2小時內處理血樣，分離血漿置于-20℃冰箱待檢測，密度梯度法分離PBMCs，分置于兩個無菌干燥離心管中，用于提取RNA及蛋白。血漿IL-1β、IL-18和高敏C反應蛋白（hs-CRP）檢測采用酶聯免疫吸附法（ELISA）。SREBP-1、NLRP1和Caspase-1的mRNA和蛋白分別采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）和蛋白免疫印跡分析（WB），引物序列：人NLRP1：上游5’-TCT GGT TCA GGG ATG CTG GA-3’， 下 游 5’-GCA CTA GTA TCT CCT GGC GTC-3’， 人 Caspase-1：上 游5’-ACA TCC CAC AAT GGG CTC TG-3’， 下游 5’-TTC ACT TCC TGC CCA CCG AC-3’， 人 SREBP-1：上游 5’-TGA CCG ACA TCG AAG GTG AA-3’，下游 5’- AAA GTG CAA TCC ATG GCT CC -3’。

統計學分析：采用SPSS 20.0統計分析軟件對數據進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（±s）表示。兩組組間數據分析采用Student's t 檢驗，三組或多組組間的數據采用單因素方差分析；相關分析采用直線相關分析法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2　結果

三組臨床基線資料比較：SAP組和ACS組吸煙史、收縮壓、舒張壓、低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯、總膽固醇與正常對照組比較差異均有統計學意義（P均＜0.05，表1）。

表1　三組臨床基線資料比較（±s）

表1　三組臨床基線資料比較（±s）

注：SAP：穩定性心絞痛；ACS：急性冠狀動脈綜合征；TG：甘油三脂；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；TC：總膽固醇。與正常對照組比較*P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

血漿IL-1β、IL-18和hs-CRP的濃度變化：SAP組與ACS組血漿IL-1β、IL-18及hs-CRP濃度較正常對照組顯著增高； ACS組血漿IL-1β、IL-18及hs-CRP濃度較SAP組顯著增高，差異均有統計學意義（P＜0.05，表 2）。

表2　研究對象血漿炎癥因子濃度比較（±s）

表2　研究對象血漿炎癥因子濃度比較（±s）

注：SAP：穩定性心絞痛；ACS：急性冠狀動脈綜合征；IL:白細胞介素；hs-CRP：高敏C反應蛋白。與正常對照組比較*P＜0.05；與SAP組比較△P＜0.05

正常對照組　20　6.65±0.73　263.71±15.00　2.29±0.41

PBMCs內SREBP-1、NLRP1和Caspase-1的表達變化：SAP組與ACS組PBMCs內SREBP-1、NLRP1和Caspase-1的表達水平（包括mRNA和蛋白）均較正常對照組顯著增高；且 ACS組患者PBMCs內SREBP-1、NLRP1和Caspase-1 的表達較SAP組顯著增高，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖1A，圖1B）。

圖1　PBMCs內SREBP-1、NLRP1及Caspase-1 mRNA表達（1A）及蛋白表達（1B）

SREBP-1 與 NLPR1、Caspase-1、IL-1β 和IL-18表達水平相關性：PBMCs內SREBP-1 mRNA表達水平與 NLPR1（r=0.851，P＜0.05）、Caspase-1（r=0.874，P＜0.05）、血漿 IL-1β（r=0.891，P＜ 0.05）、血漿IL-18（r=0.664，P＜ 0.05）表達呈明顯的正相關（圖 2）。

圖2　SREBP-1與NLRP1炎性體的相關性分析

3　討論

AS是一種慢性炎癥性疾病，炎癥反應參與AS的發生、發展及并發癥全過程[8]。AS病變早期，血液單核細胞受調控穿過血管內皮細胞，進入內皮下層，分化成為巨噬細胞[9]，吞噬修飾的氧化低密度脂蛋白膽固醇成為泡沫細胞，釋放IL-1β、IL-18等炎性因子，進而促進AS的發展。IL-1β與IL-18在動脈粥樣斑塊中高度表達，可激活炎性通路增加AS斑塊不穩定性，增大血栓事件發生概率[10，11]。本研究發現在冠心病患者血液中IL-1β和IL-18表達水平較正常對照組高，且ACS組比SAP組水平更高，進一步證實了IL-1β和IL-18參與AS的發展過程。

炎性體是位于一類細胞內的多蛋白寡聚復合體，NLRP1炎性體是Martinon等[12]在2002年發現的第一個炎性體。近年研究發現，NLRP1炎性體參與AS、系統性紅斑狼瘡和類風濕性關節炎等多種炎癥性疾病的發生發展[13，14]。NLRP1炎性體活化后，Caspase-1裂解成熟，促進pro-IL-1β和pro-IL-18裂解形成具有活性的IL-1β和IL-18[15]。小鼠腦梗模型中，NLRP1、IL-1β及IL-18表達均明顯升高，抑制NLRP1炎性體活化后，IL-1β和IL-18的表達下降，腦組織壞死面積減少[16]。體內抑制小鼠骨髓炎模型Caspase-1活性，IL-1β表達水平也相應下降[17]。在本研究中，冠心病患者PBMCs內NLRP1炎性體表達增加，且ACS組比SAP組水平更高，這與體內IL-1β和IL-18水平升高一致，說明NLRP1炎性可能參與了冠心病患者體內炎癥水平的改變。

SREBPs屬于膜轉錄因子家族，其編碼基因有兩個，SREBP-1和SREBP-2基因。小鼠體內SREBP-1還分為SREBP-1a和-1c兩種亞型。SREBP-1主要調控脂肪酸和糖代謝，SREBP-2主要參與膽固醇合成。有研究發現，SREBP-1可參與調控腫瘤、脂肪變性及巨噬細胞介導的固有免疫應答等[18，19]。SREBP-1基因敲除后，由盲腸穿孔介導的內毒素休克和全身炎癥反應受到明顯抑制，NLRP1炎性體激活受阻，IL-1β和IL-18釋放減少[20]。本課題組前期研究顯示，使用siRNA抑制THP-1巨噬細胞SREBP-1后，NLRP1、IL-18和IL-1β表達均下降，說明SREBP-1能夠激活NLRP1炎性體[7]。本實驗發現血液PBMCs內SREBP-1與NLRP-1、Caspase-1、IL-1β和IL-18表達呈正相關，進一步證實了SREBP-1可能通過激活NLRP1炎性體，促進IL-18和IL-1β釋放分泌，參與AS的發生發展。

值得指出的是，本研究存在一定局限性，首先，入選對象可能受主觀因素干擾；其次，正常對照組與冠心病患者屬非同類人群，并非嚴格的病例對照研究，可能造成一定的偏倚。

AS發病機制極其復雜，脂質代謝與炎癥是其發生發展的重要原因，二者關系密切[21]，然而其內在聯系尚未完全闡明。本研究不僅證實了冠心病患者SREBP-1與NLRP1炎性體表達升高，也進一步在體內確認了SREBP-1表達與NLRP1炎性體呈正相關關系，為以SREBP-1和NLRP1炎性體為靶點防治AS等炎癥性疾病提供新的實驗依據。

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