25?羥維生素D3電化學發光免疫分析儀測定及臨床應用

李美珠，李堅鵬，李煒煊（佛山市第一人民醫院檢驗科，廣東528000）

維生素D是一種脂溶性類固醇衍生物，是骨代謝的調節激素，具有抗佝僂病作用。由于維生素D在骨骼健康和維生素D缺乏癥中的重要作用，臨床醫生對于評估維生素D的需求日益增加。有研究表明，維生素D與糖代謝有著密切關系[1-2]。

目前，實驗室對25-羥維生素D3最常見的檢測方法有電化學發光免疫分析法和色譜法[包括高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）]。電化學發光免疫分析法的檢測原理是指在電極表面由電化學引發的特異性化學發光反應，采用三聯吡啶釕作為電化學發光劑來標記抗體，通過抗原抗體反應和磁珠分離技術，根據三聯吡啶釕在電極上發出的光強度對待測抗原或抗體進行定量或定性。該方法樣品處理簡單，獲取結果時間較短。本研究用電化學發光免疫分析法對總維生素D的性能進行分析，評價其是否符合臨床分析需求，以期成為適合臨床常規維生素D狀態評估的一個重要依據。

糖化血清清蛋白（GA）是反映過去1個月特別是最近2～3周平均血糖水平的一項指標。由于該指標與紅細胞壽命變化無關，比以前血糖檢測“金標準”糖化血紅蛋白（HbA1c）的反應周期要短。因糖尿病治療開始時血糖值多會出現劇烈波動情況，HbA1c不能立即捕捉到這一變化，而GA可以反映血糖變化。所以，確認糖尿病治療開始時的治療效果時，GA比HbA1c更為靈敏，可作為檢測血糖變化的指標。因此，GA更具有血糖水平控制和預后診斷的臨床意義。

本研究采用競爭法和酶法對糖尿病患者血清25-羥維生素D3和GA%水平進行檢測，分析探討哪種方法更適用于全自動免疫分析儀常規檢測，25-羥維生素D3水平與糖尿病GA%是否具有良好的相關性及二者與糖尿病腎病的相關性是否可作為糖尿病血糖水平控制和預后診斷的敏感指標，具有實際的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2016年1月至2017年5月在本院腎內科住院并明確診斷的216例患者，所有患者均患有糖尿病。糖尿病診斷根據1999年制定的WHO糖尿病診斷標準；糖尿病腎病根據2007年美國腎臟病基金會修訂的診斷標準。根據診斷標準將其分為糖尿病組（140例）和糖尿病腎病組（76例）。糖尿病組中男75例，女 65例；年齡 35～81 歲，平均（54.40±4.12）歲。糖尿病腎病組中男43例，女33例；年齡33～78歲，平均（55.70±4.36）歲。另隨機選取本院體檢健康者72例作為健康對照組，其中男40例，女32例，年齡30～75歲，平均（53.60±4.50）歲。

1.1.2 儀器及試劑 采用羅氏Cobas全自動免疫分析儀，試劑由羅氏公司提供，采用電化學發光法檢測了25-羥維生素D3水平。根據維生素D營養狀況的評估可分為 3組：25-羥維生素D3≥30 ng/mL 為充足；20～＜30 ng/mL為不足；＜20 ng/mL為缺乏。

1.1.3 標本采集 采集受檢者靜脈血4 mL于分離膠促凝真空采血管中送檢，立即3 000 r/min離心5 min，分離血清后2 h內檢測。

1.2 檢測方法 25-羥維生素D3采用電化學發光法，在羅氏Cobas型全自動免疫分析儀上檢測；GA%采用酶法在西門子（SIEMENS）ADVIA2400流水線檢測，分別定量檢測GA和清蛋白，然后GA%=GA濃度/清蛋白濃度×100%。實驗方法嚴格按照試劑盒說明書和SOP文件進行操作；并對檢測結果進行分析。

1.3 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料用表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 精密度測試

2.1.1 批內變異系數（CV） 分別檢測高、中、低3個不同濃度的25-羥維生素D3水平，每天測定3次，共5 d。批內CV≤3.3%。見表1。

表1 批內精密度試驗

2.1.2 批間CV 把1份混合血清標本分裝成15小支放冰格，每天拿1支測定25-羥維生素D3水平，共15 d。結果平均水平為（23.3±2.2）ng/mL，CV為4.8%。

2.2 線性試驗 按美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）EP6-P2 方案[3]，選擇 25-羥維生素D3值為 55.6、3.2 ng/mL的血清標本各1份，然后將2份血清按3∶1、1∶1和 1∶3 的比例混合，產生 55.6、42.5、29.4、16.3、3.2 ng/mL 5個不同濃度的標本，用本法重復測定4次，將測定值（Y）與理論值（X）進行線性回歸分析，r=0.995，線性回歸方程Y=1.030X+1.102，說明在3.2～55.6 ng/mL內線性良好。

2.3 正確度驗證 方案：取5份標本在用該方法與某醫院檢驗中心結果比對，得出結果偏移未超過允許范圍，比對結果通過，故正確度驗證通過，總維生素D正確度符合要求。見表2。

表2 本科室與某醫院檢驗中心的比對結果

2.4 3組25-羥維生素D3和GA%值結果比較 糖尿病組與糖尿病腎病組的25-羥維生素D3水平較健康對照組均顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）；糖尿病組與糖尿病腎病組的GA%值較健康對照組均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表3。

表3 3組25-羥維生素D3水平和GA值結果比較

2.5 糖尿病腎病組維生素D不同營養狀況下GA值比較 糖尿病腎病患者的GA%值隨25-羥維生素D3水平的降低而呈升高趨勢，且GA%值與25-羥維生素D3呈負相關（rs=-0.42，P＜0.05）。見表4。

表4 糖尿病腎病組維生素D不同營養狀況下GA%值比較

3 討 論

隨著人民生活水平的不斷提高，糖尿病已成為常見疾病。目前，我國成年人群中糖尿病總體發病率已達11.6%。糖尿病并發癥的發生是造成糖尿病患者死亡的重要原因，在我國，糖尿病腎病已成為終末期腎病的最主要病因。由于25-羥維生素D3是人體內維生素D主要儲存的活性形式，且較為穩定，在人體內半衰期較長（常為3周左右），因此，通過檢測25-羥維生素D3可以確定體內總維生素D情況[4]。

本研究結果顯示，電化學發光法25-羥維生素D3測定試劑盒的批內CV≤3.3%、批間CV為4.8%，線性范圍3.2～55.6 ng/mL，精密度和正確度較高，能滿足臨床測定的需要。本方法優點有以下方面：（1）對樣本無須預處理，采用全自動免疫分析儀，操作簡便、快速，可在短時間內得出檢測結果；（2）該法適用于標本量少、采血困難的兒科等科室；（3）成本低，較低收費標準可減輕患者經濟負擔；（4）羅氏診斷電化學發光免疫分析法總維生素D的整體性能好；（5）具有測定結果重復性好、特異性強、靈敏度高等優點，具有很好的臨床應用價值。

近年來，有學者研究顯示，維生素D水平與心血管疾病、糖代謝疾病及糖尿病等的發生、發展有關[5-7]。本研究結果表明，隨著25-羥維生素D3水平逐漸降低，GA%逐漸升高，糖尿病腎病的危險性存在增高趨勢，與文獻[8-9]研究結果一致，說明糖尿病的發生、發展與25-羥維生素D3、GA水平的變化有關。通過相關性分析結果表明，糖尿病腎病患者的GA%值隨著25-羥維生素D3水平的降低而呈升高趨勢，表明GA%值與25-羥維生素D3呈負相關。有研究通過單基因多態性研究發現，維生素D等位基因是糖尿病腎病的易感基因［10-11]。有學者研究認為，予以2型糖尿病患者補充維生素D后，患者血糖水平明顯降低，維生素D與胰島素敏感性及胰島素分泌存在密切關系[12]。

綜上所述，25-羥維生素D3缺乏與GA水平升高可能參與了糖尿病腎病的發生、發展過程，因此，監測血清25-羥維生素D3水平與GA水平對糖尿病腎病的預防和預后有重要意義。而及時補充維生素D3和降低GA水平可能是預防糖尿病腎病發生，減緩糖尿病腎病進展的一個重要途徑。本研究表明，GA%值與25-羥維生素D3水平呈負相關。因此，糖尿病患者同時檢測25-羥維生素D3與GA水平能夠更好地對病情進行評估，對于糖尿病患者定期監測這2個指標的變化可及時采取有效治療措施，對預防糖尿病腎病發生、減緩糖尿病腎病進展起到關鍵作用。

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