先天性白內障Rncat小鼠行為學檢測與分析

張 燕，王 瑩，馬 嵋，燕順生，陳欣如*

(1.新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心，烏魯木齊 830002； 2.新疆醫科大學第一附屬醫院人類疾病動物模型研究實驗室，烏魯木齊 830054)

動物行為學是科研工作者評價實驗動物狀態的重要指標，通過觀察檢測記錄動物自主活動(曠場實驗)、協調運動(足跡分析、衣架實驗、網屏實驗、滾軸實驗等)、學習和記憶力(高架十字迷宮實驗)等方面的行為學實驗，評價實驗動物運動功能、神經功能[1]和肌肉發育等整體狀態[2]。新疆實驗動物研究中心挑選發生CRYGS基因突變的KM小鼠，經過十余年的選種育種，采取全同胞兄妹交配方式，建立了先天性白內障小鼠模型，并聯合中科院上海生物工程研究中心進行品系的鑒定及實驗動物檢測，正式將其命名為Rncat小鼠[3]。本文以Rncat小鼠的近交后代和隨機交配后代為研究對象，觀察記錄其在自主活動度、協調運動、體能檢測和激惹度檢測等方面的各項指標，為其在毒理學、藥理學、神經學等學科的應用提供基礎實驗數據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

1.1.1 實驗動物分組

所有實驗動物均由新疆實驗動物研究中心提供[SCXK (新) 2016-0001]，實驗在新疆實驗動物研究中心SPF級實驗室內進行[SYXK (新) 2015-0001]。實驗組一的先天性白內障Rncat小鼠全部是Rncat小鼠全同胞兄妹近親交配后生產的小鼠，雌雄各半共40只，1.5月齡，體重為17～21 g。實驗組二的Rncat小鼠是來源于近親交配Rncat小鼠的血緣擴大群，經過5代隨機交配后生產的小鼠，雌雄各半共40只，1.5月齡，體重為17～22 g。實驗組三為BALB/c小鼠，雌雄各半共40只，1.5月齡，體重為16～20 g。實驗組四為KM小鼠，雌雄各半共40只，1.5月齡，體重為18～22 g。

1.1.2 動物實驗的環境及操作控制

實驗室溫度保持在20℃～24℃，相對濕度30%～50%，實驗定時開始于每天10～13時。實驗前一周，每天捉放撫摸實驗小鼠，讓其適應實驗人員的移動及觸碰方式。實驗開始前，將各待測小鼠分籠飼養一夜，確保小鼠正常飲食體能充沛。操作人員確定不變，實驗時身穿白色隔離服，戴一次性口罩和手套。各項實驗每只小鼠測定前，實驗人員手套及各項實驗用具均用45%濃度酒精擦拭，待氣味完全揮發后，再進行下一只小鼠的實驗。這些環境、人員及操作的控制是為了最大程度減少因人員變動、操作手法、動物氣味殘留等因素引起動物實驗數據的改變，實驗期間遵守3R原則，給予實驗動物人道關懷處理。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠自主活動度檢測：曠場實驗[4]

實驗室自制長寬高分別為50 cm×50 cm×40 cm的曠場實驗箱，將實驗箱內部涂成黑色，將箱底正方形平均分為16小格，沿箱壁的12方格記為外周格，中心4小格為中央格。箱體正上方連接視頻記錄系統。實驗動物初始被放在中央格，記錄實驗5 min之內實驗動物對各區域的探索表現。

1.2.2 小鼠協調運動度檢測：衣架實驗[5]

首先自制衣架狀器械，水平為長40 cm、直徑3 mm的細園桿，懸掛至距離實驗臺高約40 cm的半空。實驗動物初始時幫助小鼠以前爪抓住水平桿中部，同時開始計時觀察30 s。計分標準參照[6]：小鼠10 s內從水平桿上掉落記為零分，小鼠前爪能抓住水平桿記為1分，小鼠嘗試攀爬水平桿記為2分，小鼠的3只爪子能抓住水平桿記為3分，小鼠4只爪子抓住水平桿并且尾巴纏繞在水平桿上記為4分，小鼠在水平桿上行走并嘗試在水平桿末端停留記為5分。記錄小鼠從水平桿上掉落的時間或在水平桿末端的停留時間。

1.2.3 小鼠體能檢測：強迫游泳實驗[7]

用有機玻璃自制長寬高為30 cm×30 cm×20 cm的小鼠游泳盒，水深約10 cm，水溫保持在21℃～23℃，強迫每只小鼠游泳6 min后觀察記錄小鼠接下來4 min內小鼠累計不動時間。

1.2.4 小鼠激惹度檢測：懸尾實驗[8]

將小鼠尾部(距尾尖約1.5 cm)用醫用膠布固定在水平木板上，小鼠頭部距離實驗臺約10 cm左右，小鼠保持倒懸狀態2 min后，連續觀察4 min內實驗小鼠倒懸活動狀態，記錄小鼠身體下垂、完全不動的總時間。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 曠場實驗結果

各組小鼠在曠場實驗的表現中，組一小鼠在中央格、外周格的停留時間為(8135.44±3264.15) s、(287998.10±3045.52) s，與組二小鼠停留時間(8023.18±3427.26) s、(287864.32±2999.61) s相比差異無顯著性，與組三小鼠停留時間(6182.69±3105.33) s、(289356.75±3112.85) s，組四小鼠停留時間(7471.56±2990.97) s、(289047.65±3013.74) s相比差異有顯著性(P< 0.01)。在實驗中，組一小鼠移動格子(188.04±17.46)次、站立(40.02±3.85)次，與組二小鼠(183.12±19.10)次、(39.13±3.72)次相比差異無顯著性，與組三小鼠(125.75±14.28)次、(31.64±6.37)次，組四小鼠(138.74±12.31)次、(32.23±6.69)次相比各項數值差異有顯著性(P< 0.01)。各組小鼠實驗結果詳見表1。

Tab.1Results of open field test in the mice

組別Groups中央格停留時間(ms)Residencetimeinthecentralgrid外周格停留時間(ms)Residencetimeintheperipherygrid移動格子數Timesofgridambulation站立次數Stand?uptimes組一Group1813544±32641528799810±30455218804±17464002±385組二Group2802318±34272628786432±29996118312±19103913±372組三Group3618269±310533??28935675±311285??12575±1428??3164±637??組四Group4747156±299097??28904765±301374??13874±1231??3223±669??

注：與組一相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the group 1,*P< 0.05,**P< 0.01.

Tab.2Results of coat-hanger test in the mice

組別Groups實驗得分Scores在水平桿末端停留時間(s)Residencetimeattheendofthehorizontalbar從水平桿上掉落的時間(s)Latencytimeoffallingfromthehorizontalbar組一Group146±034165±458183±301組二Group247±057168±503198±276組三Group345±092?160±622?174±313?組四Group448±038169±564198±289

注：與組一相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the group 1,*P< 0.05.

2.2 衣架實驗結果

在衣架實驗中，組一小鼠實驗得分為(4.6±0.34)，與組三小鼠得分(4.5±0.92)相比差異有顯著性(P< 0.05)；組一小鼠在水平桿末端停留時間為(16.5±4.5) s，與組三(16.0±6.22) s相比差異有顯著性(P< 0.05)；組一小鼠從水平桿上掉落的時間(18.3±3.01) s，組三小鼠(17.4±3.13) s，兩組數據相比差異有顯著性(P< 0.05)。組一小鼠各項結果與組二、組四小鼠相比差異無顯著性。詳見表2。

2.3 強迫游泳實驗結果

強迫游泳實驗中，組一小鼠的累計不動時間最短，為(137.38±10.66) s，組二小鼠與其相比時間稍長(140.43±11.24) s但差異無顯著性，組三、組四小鼠的累計不動時間明顯長于組一，分別是(171.63±16.75) s和(182.62±12.53) s，與組一相比差異有顯著性(P< 0.01)。詳見表3。

2.4 懸尾實驗結果

各組實驗小鼠懸尾實驗結果見表4。組一小鼠在懸尾實驗中，累計不動時間是(104.83±11.22) s，與組二小鼠的累計不動時間(115.29±9.76) s相比差異無顯著性，與組三、組四小鼠累計不動時間相比差異有顯著性(P< 0.01)。詳見表4。

3 討論

先天性白內障Rncat小鼠，是以KM小鼠的基因突變小鼠為親本，經過新疆實驗動物研究中心十年以上的近交選育，建立的先天性白內障模型小鼠。作者在十余年的飼養過程中發現，無論是以近交繁殖或者是隨機交配繁殖的方式，該種群小鼠均能很好地保持其先天性白內障特質。

Tab.3Results of forced swimming test in the mice

組別Groups累計不動時間(s)Immobilitytime組一Group113738±1066組二Group214043±1124組三Group317163±1675??組四Group418262±1253??

注：與組一相比，**P< 0.01。

Note. Compared with the group 1,**P< 0.01.

Tab.4Results of tail suspension test in the mice

組別Groups累計不動時間(s)Immobilitytime組一Group110483±11．22組二Group211529±9．76組三Group315542±12．58??組四Group416063±12．69??

注：與組一相比，**P< 0.01。

Note. Compared with the group 1,**P< 0.01.

本實驗通過對先天性白內障Rncat小鼠進行行為學檢測，對比同月齡的Rncat小鼠與正常的近交系BALB/c小鼠及KM小鼠在自主活動度、協調運動、體能和激惹度等方面的行為數據，檢測到Rncat小鼠在行為學上與其他近交系或封閉群小鼠的不同，這些數據的差異，可能與實驗小鼠月齡相同但體重差異有關，也可能與白內障小鼠病理改變導致的行為學改變有關。

曠場實驗用于評價實驗動物在新環境的自主活動度與緊張度，以小鼠的水平活動次數評價小鼠活動的強弱。此次曠場實驗中，在相同的環境條件下，Rncat小鼠在中央格停留的時間和穿越格子的次數明顯高于其他小鼠，客觀地反映Rncat小鼠的自主活動量高于其他小鼠，可能因為該小鼠先天性白內障病理學改變，引起的焦慮相關行為學變化。此次實驗中所有小鼠在四周格的時間明顯高于其在中央格的時間，這可能與小鼠對空曠環境的恐懼感及沿壁活動的天性有關。

衣架實驗主要評價小鼠腦對肢體的肌力和協調的控制功能[9]，強迫游泳實驗直接用于測試小鼠體能，同時也反映小鼠在強迫游泳實驗時，產生“行為絕望”的表現[10]。此次實驗中Rncat小鼠與KM小鼠在衣架實驗及強迫游泳實驗中結果相近，但與BALB/c小鼠差異有顯著性，可能是由于Rncat小鼠來源于KM小鼠，相同月齡小鼠腦對肢體的控制和體能等表現相似，而由于BALB/c小鼠的近交繁殖特性導致其體形較小、體能較弱，所以其與Rncat小鼠及KM小鼠在衣架實驗中結果相比差異有顯著性。

懸尾實驗則反映實驗動物激惹程度，該項實驗評價指標為累計不動時間，實驗結果顯示Rncat小鼠與BALB/c小鼠或KM小鼠相比，累計不動時間短，為Rncat小鼠可能成為小鼠絕望模型的實驗動物提供科學數據基礎。

[1] 曾莉, 張旻, 卜碧濤. 實驗嚙齒類動物行為學評估 [J]. 神經損傷與功能重建, 2008, 3(5): 352-356.

[2] 董婷, 尼佳樂, 魏科, 等. 苯并[α]芘對新生幼鼠的海馬組織ATP酶及鈣離子的影響 [J]. 中南大學學報(醫學版), 2015, 40(4): 356-361.

[3] 金怡萍, 燕順生, 金玫蕾, 等. Rncat先天性白內障小鼠的晶狀體形態學研究 [J]. 眼科新進展, 2004, 24(5): 361-363.

[4] 尉曉娜, 謝于鵬, 夏譽, 等. 低氧對小鼠曠場行為的影響 [J]. 溫州醫學院學報, 2012, 42(1): 17-19.

[5] Lorivel T, Hilber P. Motor effects of delta 9 THC in cerebellar Lurcher mutant mice [J]. Behav Brain Res, 2007, 181(2): 248-253.

[6] 楊靜, 程九華, 呂強, 等. 短期低壓與常壓缺氧預處理對小鼠急性高空缺氧所致協調運動能力下降防護作用的比較 [J]. 空軍醫學雜志, 2017, 33(1): 1-5.

[7] 喬向陽, 王曉英, 劉宏云. 不同研究條件對BALB/C小鼠強迫游泳實驗的影響 [J]. 海南醫學, 2012, 23(2): 24-26.

[8] 李影, 孫佳明, 張靜, 等. 珍珠母不同炮制品對小鼠抗抑郁作用研究 [J]. 吉林中醫藥, 2014, 34(4): 388-389, 392.

[9] Bárez-López S, Bosch-García D, Gómez-Andrés D, et al. Abnormal motor phenotype at adult stages in mice lacking type 2 deiodinase [J]. PLoS One, 2014, 9(8): e103857.

[10] 馬行, 庫寶善, 姚海燕, 等. 對抑郁模型小鼠強迫游泳實驗方法的探討 [J]. 徐州醫學院學報, 2005, 25(3): 230-233.