卵胞漿內單精子注射(ICSI)技術規(guī)范

梁珊珊，黃國寧，孫海翔，范立青，馮云，沈浣，劉平，盧文紅，張云山，王秀霞，張松英，黃學鋒，伍瓊芳，全松，周從容，周燦權，師娟子，孫瑩璞，滕曉明

(中華醫(yī)學會生殖醫(yī)學分會第四屆委員會)

背 景

卵胞漿內單精子注射(ICSI)技術自1992年第一例嬰兒誕生起，為輔助生殖技術(ART)開辟了新的領域，并在世界范圍內廣泛應用。為推動ICSI技術在我國應用的健康發(fā)展，規(guī)范ICSI技術的操作流程，中華醫(yī)學會生殖醫(yī)學分會實驗室學組根據國內外已發(fā)表的文獻，參考國外現行應用的相關指南(ESHER 2015 Revised guidelines for good practice in IVF laboratories；NICE 2014 Fertility problems Quality standard)和中華醫(yī)學會生殖醫(yī)學分會“人類體外受精-胚胎移植實驗室操作專家共識”，結合參加編寫專家的經驗，廣泛征求胚胎實驗室技術人員意見的基礎上，基于實驗室和輔助生殖技術后代安全性立場考慮，經過交流討論達成了本ICSI操作技術規(guī)范。

方法和內容

本技術規(guī)范內容包含ICSI基本條件、操作前準備、操作過程、特殊情況處理。

一、基本條件

1.配子操作環(huán)境：與IVF實驗室配子/胚胎操作區(qū)域環(huán)境控制原則相同，并需按照技術規(guī)范，采取措施降低操作區(qū)域內VOC含量。

2.人員：ICSI技術人員需按照規(guī)范要求在輔助生殖技術培訓基地接受培訓并考核合格，再經過動物配子和人類配子操作訓練后，具備熟練的顯微操作及體外受精-胚胎移植實驗室技能。在后續(xù)工作中還需進行持續(xù)質控。

3.儀器：除IVF技術常規(guī)儀器，需要增加倒置顯微鏡及顯微操作系統(tǒng)。建議配置2套，以備檢修。顯微操作系統(tǒng)可以是液壓和/或氣壓系統(tǒng)。

開展男科顯微手術取精的中心需要配備相關顯微顯像及手術設備，開展凍精復蘇后ICSI的中心需配備相關的設備。

4.耗材和試劑：除IVF常規(guī)用品，還需要適宜管徑的拆卵針(內徑分別為450～500 μm、150～200 μm、130～140 μm的毛細管)、ICSI操作皿、無需CO2平衡的配子操作液(以下簡稱操作液)、透明質酸酶、精子制動試劑(如PVP)。

注射針和固定針有0°、20°、25°、30°、35°等多種角度，建議采用30°角。注射針的內徑一般為5 μm，外徑為7 μm；固定針內徑有15 μm和25 μm，外徑均為100 μm。

開展冷凍精子ICSI的中心需要精子冷凍及解凍試劑盒。

二、ICSI操作的準備

1.卵母細胞的脫顆粒細胞：卵丘復合物移入透明質酸酶中，顆粒細胞松散后移入配子洗滌液中，用內徑適宜的拆卵針反復吹吸，使顆粒細胞脫落。

注：透明質酸酶使用參考試劑說明書，盡量減少透明質酸酶和卵子接觸的時間(因各種酶制劑活性成分不同，如說明書中提及此時間需控制在1 min之內，則需嚴格遵照；如未提及具體時間限制，亦不可過久)；脫顆粒后充分洗滌卵子[1]。如果卵子數較多(一般超過10枚以上)，建議分批處理。

2.卵母細胞評估：去除顆粒細胞后，觀察卵母細胞。卵周間隙見第一極體提示卵子核成熟，可用于ICSI。如觀察發(fā)現GV期、MI期、特大極體(大于14 μm)、巨卵(卵子直徑大于200 μm)應不予ICSI[1]；發(fā)現多極體、胞漿空泡等需記錄；發(fā)現卵周間隙過大、極體碎裂及可疑多極體的卵子如有條件可使用紡錘體觀測儀選擇穿刺點。

全部卵子均為未成熟卵子時考慮行IVM后ICSI(實驗室學組專家共識試行指南2016)。

3.注射皿準備：可將精子制動液滴(如PVP微滴)置于注射皿中央，周圍放置配子液微滴。用礦物油覆蓋微滴。將處理后的精子懸液移入微滴，卵子逐個移入其余微滴。

注：每皿注射卵子數不宜過多(原則上可根據操作熟練程度，預計培養(yǎng)箱外操作時間不超過10 min，減少失溫對卵子產生的不利影響)。

4.操作系統(tǒng)的調試：恒溫臺溫度控制在37℃。調節(jié)注射針和固定針的手柄放置正中位置，旋鈕的指針處于正中位置。根據ICSI注射針和固定針的規(guī)格角度調試兩側持針臂的角度。裝針前保證兩側持針臂在同一矢狀面，然后在低倍鏡下安裝注射針和固定針，之后轉換高倍鏡，再調整注射針和固定針的水平位置和垂直位置。

注：顯微控制系統(tǒng)非工作狀態(tài)時，持針臂抬高。液壓系統(tǒng)更換時管道內不進空氣，保證順利通暢。建議顯微操作時使用目鏡10倍，物鏡20倍。

5.精子處理：射出精液處理同常規(guī)IVF，收集活動精子備用。冷凍精子解凍后應用，參考精子冷凍解凍試劑盒說明。附睪手術所取精子可直接裝入注射皿或洗滌后使用，睪丸組織需要機械法拆碎曲精小管，制成精子懸液備用。

注：當精液中紅細胞數量較多，精液粘稠度高或逆行射精標本建議行非連續(xù)密度梯度離心處理。

三、ICSI操作

1.ICSI時機：正常受精需要卵母細胞核成熟以及胞質成熟。胞核成熟明顯標志為第一極體排出，但胞質成熟更為復雜[2]。在自然狀態(tài)下，兩者應該同步，但在促排周期中表現非同步[3]。在IVF或ICSI前的培養(yǎng)，能使胞質進一步成熟。但長期停留在MII階段未受精，顆粒細胞凋亡可能使得卵子發(fā)生老化[4]。ICSI取卵、脫顆粒細胞、注射操作之間的最佳時間間隔尚無明確定論。現階段證據指出，HCG后>36 h取卵，帶顆粒細胞培養(yǎng)結局更好；脫顆粒>5 h后ICSI對結局會有負面影響[5-6]。建議HCG后38～40 h行ICSI授精。

2.精子制動：在精子微滴中盡量選擇形態(tài)正常的活動精子，用ICSI注射針轉移到PVP微滴中。用ICSI注射針將精子的尾部中段1/3處垂直壓在培養(yǎng)皿底部，輕柔拉動，劃破尾部胞膜后精子尾遠端停止擺動，近頭端可仍稍有擺動，有時可見明顯折痕。注：不推薦在精子微滴中或在不加PVP的操作液中進行制動。精子制動后盡快注射。

3.注射時第一極體位置：第一極體位于6點或12點，注射點3點時，精子頭或者尾先進入胞質不影響受精率和優(yōu)胚率[7]。各種研究提示，精子與紡錘體位置近可能提高受精及優(yōu)胚率[8-10]。

推薦注射時第一極體位于11～12點。

4.卵胞漿內單精子注射：將制動后的精子吸入注射針，使精子頭位于注射針尖端。將含精子的顯微注射針和固定針移入含卵子的微滴中。用固定針固定卵子，使第一極體位于11～12點位置。將ICSI注射針穿過透明帶，進入卵母細胞胞質內。穿刺針頭部過中線位置后緩慢回吸胞漿液至突然加速，提示卵母細胞破膜，停止回吸，將精子慢慢注入卵子中心區(qū)域，精子頭部進入胞質后，稍作停頓，再緩慢退出注射針。固定針釋放卵子后退出液滴。不推薦在注射針內同時間隔一定距離吸入多條精子進行ICSI，雖然可以縮短注射時間，但增加了ICSI操作難度和風險。

注射后的卵子移入培養(yǎng)皿內，放入培養(yǎng)箱，同IVF胚胎培養(yǎng)。

注：盡量減少注射入卵胞質內的PVP。

四、特殊情況處理

1.MI卵：臨床上約有15%卵子處在未成熟階段，但因臨床和技術難度，IVM技術仍然只在少數中心作為常規(guī)操作[11]。2010年研究提示，經過24 h培養(yǎng)成熟的卵子非整倍體率100%，經4～8 h培養(yǎng)成熟時非整倍體率為66.6%，短期(2 h)培養(yǎng)成熟時非整倍體率接近正常PGD(40.3%)[12]。盡管使用MI成熟后受精的胚胎可以增加數量，但由于高的非整倍體率和臨床結局不良，需要考慮非整倍體篩查[13]。

2.卵子退化：ICSI后卵子退化率可在5%～19%[14-15]，目前一般在5%左右。可發(fā)生在進針/出針時胞漿溢出，或者第二天檢查受精時發(fā)現胞質固縮[16]。

2006年研究提示，D3 FSH水平、獲得成熟卵數、HCG日E2水平是卵子退化率的獨立顯著相關因素[16]。發(fā)生卵胞膜突然破裂、破裂困難[14]、抽針后無針道[17]可能與卵子退化率增高有關，提示卵子質量差。透明帶異常、細胞骨架損傷可能與卵子退化相關。脫顆粒細胞不完全時，雖然可以繼續(xù)胚胎發(fā)育，但也與退化率增高有關，原因可能是注射時遮擋視線以及固定困難[18]。

建議使用3～5 μm內徑的細針(常規(guī)使用直徑5～7 μm)，優(yōu)點是卵胞膜損傷小、胞漿吸出少、進入的PVP少。建議控制正常形態(tài)MII卵子注射后正常受精率不低于70%，卵子退化率不高于10%。

前次卵胞膜突然破裂、高退化率(>20%)的卵子經過激光輔助孵化(AH)后受精率可增高，胚胎質量改善[19]。AH理論上可能誘發(fā)孵出時囊胚嵌頓，但尚無單卵雙胎報道。對非選擇性患者AH后ICSI并無明顯益處[20]。

3.裸卵：體外操作時透明帶丟失而卵胞膜完整，或卵子生成時透明帶缺如的卵母細胞稱為裸卵。透明帶先天缺如者可能涉及遺傳異常。裸卵多數丟棄，但獲卵數很少的時候可以培養(yǎng)至囊胚期移植并獲得妊娠[21]。2014年研究135枚裸卵與正常卵子對比，受精率、卵裂率、囊胚形成率、優(yōu)質囊胚率均無顯著差異，解凍復蘇率及活產率、孕周及出生體重無顯著差異[22]。但不建議卵裂期移植，以避免卵裂球分離。

4.受精失敗：ICSI完全受精失敗少見，發(fā)生率約1%～3%，但即便是精子正常時也可能發(fā)生[23]。低受精率<30%會在某些患者身上重復發(fā)生[24]。

IVF受精失敗時60%～90%卵子不含精子核，提示主要原因是精子穿透失敗[25]；但ICSI受精失敗時60%～70%的未受精MII卵子中可見腫脹的精子頭，提示與卵子活化異常有關；其他原因還有精子頭解聚異常、精子染色質解聚異常、紡錘體異常、精子星狀體異常和單純精子注射失誤等[26-27]。

小鼠卵活化實驗(MOAT)可用來鑒別精子受精能力[28]。受精率可分為低活化率(<20%)、中等(21%～84%)、高(>85%)。精子異常大多表現為低活化率，高活化時基本可排除精子異常。圓頭精子癥患者理論上AOA結局良好。對于MOAT高活化率組受精低下的患者可能還有其他因素，建議部分卵子AOA[28-29]。

卵子人工激活(AOA)可對精子及卵子活化異常起作用。顯微操作改良、物理(電)、化學方法等方案多樣。

人類卵子人工激活安全性研究現有2014年報道21名經AOA出生的已超過3歲的子代隨訪，新生兒期指標、行為及神經發(fā)育在正常范圍內[30]。更加全面的安全性討論尚需病例積累及長期隨訪。

5.圓頭精子：所有精子均為圓頭精子患者臨床罕見，發(fā)生率<0.1%。特征是精子頭為圓型，頂體缺失，核胞膜異常，中段缺陷。DNA碎片顯著增高，但非整倍體率輕微升高[31-32]。ICSI技術出現之前，此類患者不育。但常規(guī)ICSI后仍受精率低，出生率低。

2013年34名圓頭精子癥患者AOA化學法受精率正常。而無論是常規(guī)ICSI還是AOA后，DPY19L2突變患者比非突變者受精率均稍高。對部分圓頭精子的患者建議部分卵子AOA，鑒別卵子異常[33]。

6.不動精子：高倍鏡下持續(xù)觀察精子未見任何主動運動的稱為不動精子。射出精子如100%不動，可行睪丸穿刺盡量取活動精子。

鑒別存活精子可采用添加己酮可可堿[34]、低滲腫脹實驗、激光法[35]或機械法折尾[36]等，存活精子可表現為尾部腫脹或因刺激發(fā)生卷曲及抖動。注意：經冷凍解凍后精子尾部可自發(fā)腫脹卷曲，不能直接認定為活精子。

7.其他：針對一些可能受精率低下的特殊病例時，會選取除常規(guī)IVF及ICSI之外的其他授精方式。例如一半卵子IVF/一半卵子ICSI的half-ICSI方式，或是加精后當日去除顆粒細胞觀察第二極體排出情況的rescue-ICSI，ICSI的操作過程無特殊要求。

結 語

本規(guī)范的適用范圍為我國實施卵胞漿內單精子注射技術的生殖中心。制定本規(guī)范的目標是協助各中心的胚胎實驗室制定適合的標準化操作常規(guī)，指導臨床胚胎學家應對可能遇到的問題，獲得更好的臨床結局。