冷凍保存對人類精子線粒體DNA的影響

傅龍龍，周芳，安琪，張開舒，童越，許劍鋒，王曉尉，郭穎，李鴻，袁冬，盧文紅，梁小薇，谷翊群

(1.國家衛生計生委科學技術研究所 國家衛生計生委男性生殖健康重點實驗室 男性臨床研究室/北京人類精子庫，北京 100081；2.北京協和醫學院研究生院，北京 100730；3.青島大學附屬醫院生殖中心，青島 266000)

線粒體是精子內除細胞核以外，唯一攜帶遺傳物質的細胞器；與細胞核的遺傳系統構成了一個整體。線粒體DNA(mitochondrion DNA，mtDNA)是一條雙鏈環狀的DNA，共含有16 569個堿基對，有自己的遺傳系統和自己的蛋白質翻譯系統，且部分遺傳密碼與核密碼有不同的編碼含義。人類線粒體基因組共編碼了37個基因，編碼13 種蛋白質，22種tRNA和2種rRNA[1]。這13種蛋白質與核DNA編碼蛋白參與線粒體氧化磷酸化，是機體提供能量和物質代謝的重要基礎。隨著mtDNA研究的不斷深入，mtDNA成為衡量線粒體功能的重要生物標記物[2]；研究者在異常精液中發現mtDNA突變與缺失[3-5]與男性不育、精液質量下降等生殖相關疾病密切相關。

精液冷凍是輔助生殖技術發展的重要保障：為中重度少弱精子癥男性進行精液凍存，用于后期輔助生殖；凍存志愿者精液，為男方無精子癥夫婦提供精子；為放化療前腫瘤患者、輸精管絕育術前患者、移植患者等進行自體精液保存，保存生育力[6]。精子冷凍損傷是精子冷凍和復蘇過程中，由于滲透壓改變、細胞內外冰晶形成、冷凍保護劑的毒性等因素，不可避免的都會發生一些物理和化學損傷。冷凍復蘇過程會降低精子質量[7-8]：活力下降、受孕率減少，頂體完整性降低，精子線粒體膜電位降低。冷凍損傷是否會引起mtDNA水平的破壞，從而降低精子相關功能？本研究觀察冷凍保存前后人精子線粒體mtDNA拷貝數和完整性的變化。

資料與方法

一、研究對象和分組

1.精液樣本收集：本研究得到國家衛生計生委科學技術研究所倫理委員會通過，所有志愿者簽署知情同意書。標本來源于北京人類精子庫捐精志愿者，禁欲5～7 d后，手淫法取精留存于消毒干燥取精杯中，置于37℃水浴完全液化后，按照世界衛生組織操作指導規范分析精液。選取符合捐精條件的正式志愿者為研究對象：精子濃度>60×106/ml，前向運動精子(PR)百分比>60%，PR復蘇率>60%。

2.精液分組：收集研究對象精液，待精液完全液化后，每份精液樣品分為2份：1份進行精液冷凍復蘇處理，納入實驗組；1份為新鮮精液，納入研究對照組。

二、研究方法

除特殊說明，本實驗采用的相關試劑均來自于美國Sigma公司。

1.精液冷凍及復蘇：本研究中，實驗組采用北京精子庫精液操作流程進行精液冷凍復蘇[9]：1份體積甘油-卵黃-檸檬酸鹽(自制)冷凍保護劑逐滴加入到2份體積精液中，充分混勻裝入冷凍管，在30～35℃孵育10 min。將冷凍管放入程控冷凍儀中(Planner，英國)，進行冷凍降溫。精液于液氮保存2周后復蘇：37℃水浴快速復溫5～10 min。對實驗組和研究對照組精子均進行精子活力、mtDNA拷貝數和完整性檢測。

2.Markler計數板聯合CASA法評估精子活力：采用Makler板(Sefi Instruments，以色列)，在400倍光學顯微鏡下最少計數200個精子。計數精子總數和PR精子數，計算精子濃度和PR百分比。并采用計算機輔助精子動態圖像檢測系統CASA(IVOS，Hamilton Thorn Research，美國)分析運動參數：平均路徑速率(Average path velocity，VAP)、直線速率(Straight-line velocity，VSL)和曲線速率(Curvilinear velocity，VCL)。

3.精子總DNA提取：充分混勻精液后，根據每份標本收集精子數為20×106個的標準，取相應體積的精液。將所取精液，與PBS液以體積比1∶2的比例進行混勻，1 000 g離心5 min，小心吸取并丟棄上清液。再加入1 ml PBS液，輕柔吹打，重懸精子后，1 000 g離心5 min，并重復兩次。留取精子沉淀團，使用DNA提取試劑盒(北京天根生化)提取精子基因組DNA，稀釋至10 ng/μl，-80°凍存備用。

4.實時熒光定量PCR(qPCR)檢測mtDNA拷貝數：選取mtDNA編碼的16SrRNA為目的基因[10]，以核編碼β-actin為內參基因，半定量檢測mtDNA拷貝數。兩基因引物由Invitrogen(上海)公司合成，引物序列詳見表1。使用ABI PRISM 7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)進行擴增，獲得各樣品所擴展基因的CT值、擴增曲線和溶解曲線。擴展反應體系為20 μl：2×UltraSYBR Mixture(With ROX)(北京康為世紀)10 μl、上游引物(10 μmol/L)0.4 μl、下游引物(10 μmol/L)0.4 μl、DNA模板2 μl。擴增程序為：95℃10 min，(95℃15 s，60℃ 60 s)×45個循環。同時在60～95℃進行溶解曲線分析，根據溶解曲線圖，評價引物特異性。采用基因的CT值，對mtDNA 拷貝數進行相對定量[9]：mtDNA拷貝數=2-△ct，其中△ct=CT16srRNA-CTβ-actin。

表1 引物序列

5.長鏈PCR方法檢測精子mtDNA完整性：采用長鏈PCR方法擴增mtDNA 8 700 bp片段。引物由Invitrogen(上海)公司合成，詳見表1。使用A100 PCR儀擴增，反應體系20 μl：2×Es Taq MasterMix(Dye)10 μl、上游引物(10 μmol/L)0.4 μl、下游引物(10 μmol/L)0.4 μl、DNA模板(10 ng/μl)2 μl，加入滅菌蒸餾水至20 μl。擴增程序為：95℃ 5 min，(95℃ 30 s，62℃ 60 s，72℃ 1 min)×30個循環，72℃延伸5 min。以8 700 bp片段產物評價精子mtDNA的完整性；采用Quantity One v.4.6.2軟件讀取8 700 bp條帶電泳強度值。為了消除mtDNA數量的影響，將長鏈PCR擴增后的8 700 bp條帶的電泳強度值與相對應的拷貝數進行標準化處理：電泳強度值/mtDNA拷貝數。

三、統計學分析

結 果

一、一般資料

共納入22例符合北京人類精子庫捐精條件的正式志愿者。納入志愿者年齡為(27.8±3.0)歲，禁欲天數(6.1±0.9)d。志愿者精液體積為(5.0±1.5)ml，精子濃度(75.8±15.8)×106/ml，前向運動精子百分比為(68±6)%。采用北京精子庫精液操作流程進行精液冷凍，22名志愿者總活動精子復蘇率為(72±8)%。

二、冷凍保存對人精子的影響

1.冷凍保存對精子活力影響：冷凍復蘇后前向運動精子百分比顯著降低(P<0.05)；冷凍保存后精子活力明顯降低，VSL、VCL和VAP均顯著低于新鮮精液組(P<0.05)(表2)。

2.冷凍保存對人精子mtDNA拷貝數的影響：按照mtDNA拷貝數=2-△ct，△ct= CT16srRNA-CTβ-actin，計算各樣本mtDNA拷貝數。新鮮精液組精子mtDNA拷貝數為(5.66±5.53)，冷凍復蘇組精子mtDNA拷貝數為(10.12±8.41)，配對樣本t檢驗顯示冷凍復蘇組精子mtDNA拷貝數較新鮮精液精子顯著增加(P<0.05)。

表2 冷凍保存對精子活力及運動參數量影響

注：與新鮮對照組相比，*P<0.05

3.冷凍保存對人精子mtDNA完整性的影響：以8 700 bp條帶擴展相對強度值計算mtDNA完整性，冷凍復蘇后精子組與新鮮精液精子組無統計學差異[(29.69±15.04)vs.(32.78±16.0)，P=0.077]，暫不認為冷凍復蘇會降低精子mtDNA的完整性。

討 論

精子冷凍保存技術發展至今，已有幾十年的歷史，其在輔助生殖技術中起到了至關重要的作用，且到目前為止，精液冷凍也是目前唯一有效的男性生育力保存的方式。隨著冷凍方法和冷凍保護劑的不斷改良，精子的存活率有了一定提高，但對精子功能等仍然會造成了一些不可逆轉的影響。本研究結果中也發現，精液冷凍明顯降低精子活力、減少RP百分率、降低精子運動參數。但活力和形態的改變，很難全面評估冷凍復蘇后的精子質量；因此尋求多指標評價精子質量，篩選優質精子進行后期輔助生殖尤為重要。

凍融后精子遺傳物質的改變一直受到相關領域研究者的關注[11]。我們團隊早期研究發現精子冷凍會增加核DNA碎片[12]，此后在越來越多的證據得到相類似結果[13]。我們對冷凍損傷對人精子DNA甲基化相關影響也進行相關探索[9]。

mtDNA是核DNA以外的遺傳物質，mtDNA拷貝數和完整性是評價精子功能的重要指標之一。mtDNA拷貝數與常規精液參數如精子濃度、精子總數、精子活率及正常形態精子率呈負相關[4-5，14]；它對成功受精和胚胎形成具有極大的重要性，與胚胎發育密切相關[15]。mtDNA完整性也與精子質量相關[3-5]：精液質量越高，mtDNA完整性越好；精液質量越差，mtDNA完整性越差。冷凍技術是否會對精子mtDNA的完整性和拷貝數產生影響，鮮有報道。

本研究初步探討了冷凍保存對于人類線粒體DNA完整性和拷貝數的影響，采用qPCR和長鏈PCR技術分別檢測冷凍前后精子mtDNA的拷貝數和完整性，以進一步研究冷凍損傷導致精子功能降低的相關因素。不同的實驗方法，所測的結果存在差異[16]。本實驗采用的qPCR不僅可以半定量，而且特異度高，可以排除假基因的干擾；且相比于二次測序技術[17]操作簡單，對樣本制備和數據處理的要求較低，易于大量使用和推廣。本實驗中22例合格供精志愿者新鮮精液mtDNA拷貝數及完整性檢測結果，與Zhang等[5]研究結果相近。精子冷凍復蘇后mtDNA拷貝數增加，這與卵母細胞冷凍相關研究相一致[18-19]。本研究通過長鏈PCR測量mtDNA完整性，并在每個精子樣品中用mtDNA拷貝數歸一化，進行量化比較。但目前結果暫未發現凍融后精子mtDNA完整性發現明顯變化。國內蔡學泳等[20]關于冷凍保存對人類卵母細胞線粒體DNA缺失的研究也發現卵母細胞mtDNA缺失率和mtDNA拷貝數在冷凍處理前后均無統計學差異。不同于核DNA的穩固，mtDNA多以拷貝的形式存在于線粒體中，且沒有組蛋白的保護，線粒體DNA修復的途徑也并不完善；因此，線粒體中的氧化損傷比細胞核中的氧化損傷高，mtDNA所累積的突變是細胞核基因組的10～50倍[21]。

目前研究認為冷凍復蘇過程中，精子內氧自由基和抗氧化劑防御體系平衡的喪失，過量的ROS產生，是引起精子冷凍損傷的重要因素。不同于其他細胞結構，成熟精子胞質少，且線粒體集中分布于精子中段，所以精子抗氧化能力減弱且缺乏修復能力，極易受到ROS損傷[22]。相關臨床研究也顯示[23]：ROS會引起精子功能降低與男性不育、女性復發性流產、兒童先天畸形等生殖相關疾病，存在密切相關性。本研究結果顯示，在捐精合格志愿者人群中，冷凍過程會增加mtDNA拷貝數，但對mtDNA完整性的影響不大。可能的原因是[20，24]：ROS刺激引起線粒體呼吸鏈功能受損，ATP合成受到抑制，為了彌補損傷后的功能缺陷，拷貝數代償性增加；但目前冷凍過程中ROS的蓄積，尚未引起mtDNA完整性的改變。

我們研究了現有冷凍復蘇技術對精子mtDNA拷貝數和完整性的影響，但受到條件限制，本實驗凍存時間尚未達到臨床保存所需時間要求。后期需要進一步擴大研究人群、增加樣本量、延長冷凍及納入精子參數相關性研究，為精子冷凍損傷的機制進行進一步研究。