轉EPSPS基因抗除草劑棉花在雜交制種中的應用初探

高明偉 王秀麗 張超 陳瑩 姜輝 王家寶 柴啟超 王永翠 趙軍勝

摘要：以轉EPSPS基因抗除草劑棉花種質為父本，以不具有除草劑抗性的普通陸地棉種質為母本，實施不去雄直接授粉配置雜交組合，并繼而對其F1代雜交種苗期進行除草劑篩選鑒定，據此探討出一種簡化制種方法。SSR分子標記檢測結果表明，該方法可以得到100%純度的雜交種。該方法進一步改良后可以結合營養缽育苗在棉花雜交制種中推廣，在簡化制種技術上有重要利用價值。

關鍵詞：棉花；EPSPS基因；除草劑；赤霉素；簡化制種

中圖分類號：S562.035.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）03-0029-04

Abstract In this paper， a simplified method of cotton hybrid seed production was discussed. The EPSPS transgenic cotton with herbicide resistance was used as the male parent， and the normal upland cotton germplasm was used as the female parent to carry out cotton seed production through direct pollination without castration， and then the F1 hybrids with herbicide resistance were screened out at seedling stage. The SSR molecular marker detection results showed that the simplified seed production method could produce 100% pure hybrids. This method can be further improved and popularize in the hybrid seed production of cotton with the combination of seedling nursing with nutrient bowl， which will have important utilization value in simplified seed production technology.

Keywords Cotton； EPSPS gene； Herbicide； Gibberellin； Simplified seed production

種植抗除草劑棉花可以擴大棉田殺草譜，使田間雜草防除變得簡便易行，是降低除草成本、提高植棉效益的有效途徑[1]。草甘膦（glyphosate） 是目前廣泛應用的內吸型廣譜性除草劑，它通過抑制植物體內芳香族氨基酸合成途徑中的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）的活性，阻斷芳香族氨基酸的合成，從而殺滅雜草，對植物無選擇性[2]。國內外科技工作者先后創制出轉G6-EPSPS、CP4-EPSPS、GR79-EPSPS等基因的抗除草劑棉花種質[4-6]，為培育具有我國自主知識產權的抗草甘膦棉花品種奠定了基礎。研究表明特定濃度的草甘膦可以誘導轉EPSPS基因棉花產生雄性不育，因此在棉花育種及雜交制種中研究較多，可用于簡化制種[7-11]。然而此前的研究均是以抗除草劑棉花作為母本進行簡化制種，但抗除草劑棉花只作母本也限制了雜種優勢的充分利用。本研究擬初步探討一種以轉EPSPS基因棉花種質作父本進行簡化制種的方法，為抗草甘膦棉花育種應用以及商業化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

抗除草劑棉花品系R02及R118：利用引自浙江大學以中棉所49為受體的轉G6-EPSPS基因的原始抗除草劑材料，與本課題組自育材料回交轉育而成。

非抗草甘膦品系為G35：本課題組自育材料。

除草劑：41%農達（孟山都公司生產的草甘膦）。

1.2 試驗方法

1.2.1 組合配制 2016年將R02、R118和G35種植于山東棉花研究中心臨清試驗站，管理措施同大田。共有兩組雜交組合，組合1為G35×R02，組合2為G35×R118。

母本處理方式分為兩種，即處理A為對照，不噴施赤霉素；處理B為現蕾后15 d，用濃度為100 mg/kg的赤霉素整株均勻噴施，此后每隔10 d噴施同等濃度赤霉素1次，共噴3次。試驗用赤霉素為Sigma公司生產的分析純G7645。

母本開花后不去雄，用父本直接進行人工授粉，并在盛花期調查母本兩個處理下連續20棵棉花的柱頭長度。

1.2.2 雜種田間除草劑篩選鑒定 2017年將親本R02、R118和G35及上年度獲得的4組雜交種種植于山東棉花研究中心臨清試驗站，每個材料種植3行，面積為20 m2。

在苗期選擇晴朗天氣用100倍41%農達除草劑噴施葉片，3 d后觀察表型。G35與非抗單株葉片邊緣皺縮枯萎，R02、R118與抗性單株葉片無變化。對表型進行統計，雜種中抗性單株標記為真雜種。

1.2.3 雜種室內分子鑒定 提取全部抗性單株及親本DNA，利用棉花基因組SSR標記對雜交種真偽性進行分子鑒定。棉花基因組DNA提取采用簡化的CTAB法[12]，DNA用1×TE溶解，稀釋到50 ng/μL備用。選擇多態性好的核心引物用于雜交種分子鑒定[13-15]，SSR標記序列來自棉花標記公共數據庫CMD（http：//www.cottonmarker.org/），引物由上海鉑尚生物科技有限公司合成。

PCR擴增在ABI9700PCR儀上進行，體系為20 μL，包括2×EasyPCR mix 10 μL，DNA模板1μL，ddH2O 9 μL。反應程序為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸50 s，30循環；72℃延伸10 min。PCR產物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，銀染后[16]用凝膠成像系統記錄電泳分離結果。

1.3 數據處理

數據采用DPS軟件處理，用t檢驗法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 赤霉素處理后柱頭伸長效果

如圖1所示，經赤霉素噴施誘導后，母本G35柱頭明顯伸長。未進行赤霉素誘導的處理A的柱頭平均長度為0.05 cm，而處理B的柱頭長度平均為1.03 cm，柱頭平均伸長近1.0 cm，差異達到極顯著水平（表1）。

2.2 制種純度的田間鑒定

抗除草劑單株和非抗單株對41%農達的敏感性明顯不同，噴施農達3 d后，非抗單株生長明顯被抑制，葉片邊緣皺縮，局部出現壞死斑，而抗性單株生長正常（圖2）。根據葉片對農達的反應程度對各處理組合制種純度進行田間鑒定，結果如表2所示：不噴施赤霉素情況下，組合1的田間鑒定純度為36.09%，組合2的田間鑒定純度為37.32%，平均純度為36.71%；赤霉素誘導后，組合1的田間鑒定純度為43.40%，組合2的田間鑒定純度為48.31%，平均純度為45.86%。這說明赤霉素誘導后柱頭伸長，在一定程度上降低了棉花自交率，但是在本研究中差異不顯著，效果不理想。

2.3 雜種純度分子鑒定

用棉花基因組SSR標記對具有除草劑抗性的雜種植株做進一步分子鑒定，以明確其是否為真雜種。選取多態性較好的256對SSR引物對3個親本進行差異篩選，共獲得9個差異共顯性標記（表3）。

對組合1、組合2的F1存活單株分別進行SSR檢測，結果顯示存活的單株均為真雜種，純度為100%。圖3、圖4分別為用CGR5732 和NAU1221標記篩選部分F1單株的結果。

3 討論與結論

雜種優勢利用是提高棉花產量的有效途徑之一。利用不育系和人工去雄是目前生產雜交種的主要方式，但是不育系制種在很大程度上限制了親本選配，而人工去雄費工費時、成本高，因此探討不去雄直接授粉的簡化制種為解決雜交制種難題提供了可能。本研究初步探討了以轉EPSPS棉花種質為父本的簡化制種方法。本試驗還嘗試對母本進行赤霉素誘導，結果處理后柱頭伸長，在一定程度上降低了自交結實率，制種純度高于未經赤霉素處理的對照，但效果并不理想。張銀虎[17]對sGK321進行赤霉素誘導處理，優化結果顯示濃度在100 mg/kg時制種產量及純度能達到理想水平。本研究未能達到同樣水平，可能是與所用的母本基因型不同有關，因此下一步有必要針對母本G35進行赤霉素誘導最適濃度的探討。

本簡化制種方法以非抗除草劑材料作母本，抗除草劑材料作父本，制種所得種子經過田間除草劑篩選處理及分子標記檢測，存活植株全部為真雜交種，說明這種簡化制種方式在生產上具有可行性。浸種是農業生產上常用的種子處理技術，具有易操作、高效、低成本的特點，有研究表明利用草甘膦浸種法鑒定轉基因抗草甘膦棉花是可行的[18，19]，可以對本簡化制種方法獲得的種子進行草甘膦浸種，有效去除母本自交株?？紤]到雜交種生產上多用營養缽育苗移栽的方式[20，21]，也可以對苗床用草甘膦預處理，保證大田使用的雜交種的高純度。因此，該方法進一步優化后可應用于棉花雜交種子的生產，以達到簡化制種省工的目的。

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