重癥肌無力相關抗體及檢測方法研究進展

雷國華 劉建軍 李尊波

[摘要] 重癥肌無力是抗體介導、累及神經-肌肉接頭的獲得性自身免疫性疾病，除了常見的乙酰膽堿受體抗體及肌肉特異性酪氨酸激酶抗體外，重癥肌無力還存在其他臨床少見抗體；通過對重癥肌無力中出現的多種相關抗體及檢測方法分析，提高對該疾病的進一步認識。

[關鍵詞] 重癥肌無力；連接素抗體；蘭尼堿受體抗體；放射免疫法；熒光細胞染色方法

[中圖分類號] R746.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）05-0165-04

[Abstract] Myasthenia gravis is an antibody-mediated acquired autoimmune disease， which involves in neuromuscular junctions. In addition to common acetylcholine receptor antibodies and muscle-specific tyrosine kinase antibodies， there are other clinically rare antibodies of myasthenia gravis. Through the analysis of a variety of myasthenia gravis related antibodies and detection methods， further understanding of the disease is improved.

[Key words] Myasthenia gravis； Catenin antibody； Raney-base receptor antibody； Radioimmunoassay； Fluorescent cell staining

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）主要是由乙酰膽堿受體抗體（acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab） 介導、累及神經-肌肉接頭的獲得性自身免疫性疾病。全身型MG患者中約80%可檢測出AChR-Ab，僅有不足10%的MG患者肌肉特異性酪氨酸激酶抗體（muscle-specific tyrosine kinase，MuSK）陽性[1]，但是，仍有小部分MG患者血清AChR-Ab和MuSK-Ab均呈陰性，這部分MG被稱之為血清雙陰性重癥肌無力[2]。隨著檢測方法的不斷提高，血清雙陰性MG患者中發現了多種MG相關抗體，現主要對MG臨床少見抗體及檢測方法進行總結，提高對該疾病的進一步認識。

1 MG相關抗體

1.1 常見抗體

20世紀70年代Lindstrom等[3]在85%MG患者的血清中檢測到AChR-Ab，從而確立了MG在B細胞介導的自身免疫性疾病中的地位。2001年Hoch W等[4]在70%AChR-Ab陰性MG患者的血清中發現了MuSK-Ab。AChR-Ab主要有IgG1和IgG3亞類，其通過補體介導的突觸后膜損傷，受體胞吞以及AChR阻滯作用產生嚴重的AChR損失[5]，MuSK-Ab為IgG4亞類，其不激活補充，主要是與低密度脂蛋白受體相關蛋白4（low-density lipoprotein receptor-related protein 4，LRP4）相互作用，從而抑制蛋白依賴性的AChR聚簇[6]。LRP4 又被稱為多表皮生長因子樣域7（multiple epidermal growth factor-like domains 7，MEGF7），2011年，Higuchi O等[7]首次在dSN-MG患者血清中檢測出了LRP4-Ab，LRP4-Ab屬于IgG，過去一直認為LRP4 與脂質代謝、肢體發育等有關[8]。近年來研究發現，其通過抑制神經元釋放的Agrin與胞外LRP4的結合，使得Agrin-LRP4-MuSK信號傳導通路破壞而致病[9]。然而，MG發病中，AChR-Ab損害突觸后膜，PsmR-Ab通過抑制突觸前膜慢K+通道，使得突觸前膜的動作電位時程延長，導致乙酰膽堿囊泡遷移及釋放改變，從而影響肌纖維興奮收縮的發生，最終導致信號釋放階段的障礙。

1.2 檸檬酸提取物相關抗體（CAE-Ab）和連接素抗體（Titin-Ab）

60年代初人們利用免疫熒光技術發現在MG患者血清中含有與骨骼肌橫紋肌切片交叉著色的一種自身抗體，其后證明了胸腺的肌樣細胞與該抗體反應[10]。檸檬酸提取物相關抗體（citric acid extract antibody，CAE-Ab），存在于胸腺、骨胳肌及心肌。1981年，Aarli JA等[11]在胸腺瘤MG患者的血清樣品發現能與MG患者產生反應的骨骼肌檸檬酸提取物抗原成分為Titin蛋白，該蛋白又稱連接素，是骨骼肌和心肌中除粗細肌原纖維之外的第3種結構蛋白，該蛋白長約1 μm，由27000個氨基酸組成。Titin蛋白特殊的排列方式可增強肌節的穩定性、靜止張力。隨后，Gautel M等[12]證實Titin蛋白的主要免疫原性區域被稱為titin-30，位于A/I帶交界區，另一個免疫原性區域位于N1和N2之間。近年來，連接素抗體（titin antibody，Titin-Ab）被認為是MGT患者血清中重要的自身抗體之一。MG與胸腺功能紊亂之間存在相互關系，約75%MG患者存在不同程度的胸腺異常[13]。CAE-Ab多見于MGT，黃載慧等[14]利用ELISA方法檢測CEA-Ab及Titin-Ab兩種抗體診斷MGT，結果顯示對于診斷同一病理類型MGT敏感性及同一種Osserman分型抗體陽性檢出率無明顯差異。武茜等[15]研究發現CAE-Ab對MGT發病具有顯著相關性，前縱隔腫瘤患者術前檢測CAE-Ab結合CT檢查，可提高診斷胸腺疾病的敏感性。

1.3 二氫吡啶受體抗體（DHPR-Ab）與蘭尼堿受體抗體（RYR-Ab）

二氫吡啶受體（dihydropyridine receptor，DHPR）是細胞膜上的L型電壓門控鈣離子通道和電壓感受器，骨骼肌、心肌中含量較高。Maruta T等[16]研究了MG患者與興奮-收縮（excitation-contraction coupling，E-C）偶聯有關的自身抗體，在37%的胸腺瘤MG患者中檢測到DHPR-Ab。蘭尼堿受體（ryanodine receptor，RyR）是位于肌質網中的鈣通道蛋白，因能和一種植物堿Ryanodine結合而命名，其有骨骼肌（RyR1）和心肌（RyR2）兩種形式，MG患者的RyR-Ab與兩者均可反應。RyR是由4個同源亞基組成四聚體，是一種含有5035個氨基酸，分子量為565 kDa的蛋白質，RyR主要在橫紋肌組織中表達，上皮組織和神經元中也可出現。肌膜去極化電位通過T管到達肌質網的終端池，誘導RyR的構象變化，使鈣內流，從而觸發骨骼肌細胞收縮[17]。RyR-Ab可減弱這種作用，可能是由于胸腺的部分RyR與之產生反應從而使T細胞致敏，進一步刺激B細胞產生RyR-Ab，骨骼肌不能有效收縮而導致肌無力。有研究顯示[18]骨骼肌中DHPR和RyR的信號轉導為雙向的，兩者之間機械和化學的雙向偶聯機制是E-C的基礎。除神經肌肉的傳導異常，MG與肌肉的興奮收縮偶聯受損相關，DHPR-Ab是伴胸腺瘤的MG的又一個新標志，可能與肌肉的興奮收縮耦聯有關。

1.4 電壓門控性鉀通道抗體（Kv-Ab）

Kv抗體常見的有Kvl.1、Kvl.2或Kvl.6，而抗Kvl.4抗體主要存在于骨骼肌、心肌及腦中。Suzuki S等[19]在2005年利用兔耳肌細胞提取物作為抗原來源，S35標記的橫紋肌肉瘤細胞中發現Kvl.4抗體，924例MG患者中發現8例（男1例，女7例）發展為炎癥性肌病，但存在非肌炎特異的自身抗體，其中3例患者發現抗Kvl.4抗體。MG相關的炎癥性肌病的臨床和免疫學特征與多發性肌炎不同，首先，心肌受累和胸腺瘤在多發性肌炎中并不常見[20]。其次，MG患者相關的炎癥性肌病的自身抗體與多發性肌炎患者中的肌炎特異性自身抗不同[21]。Kvl.4抗體陽性的MG患者易發生延髓型肌無力、胸腺瘤及心肌炎。目前關于Kvl.4抗體的MG的報道較少，其在MG發病機制中的作用尚需進一步探討。

1.5其他更少見抗體

MG還可出現膠原蛋白XIII抗體、聚蛋白抗體、DHPR-Ab、抗補體C5-Ab、HSP70-65-Ab、IFN抗體[22]等臨床少見抗體。值得注意的是：①IFN抗體在MG伴胸腺瘤患者外周血中水平較高，IFN具有抗腫瘤作用，并且具有多生物學效應，主要由白細胞、成纖維細胞產生的一種細胞因子[23]。②膠原蛋白是稱為MACITs（具有間斷的三螺旋的膜相關的膠原蛋白）的膠原亞組的成員，由短的胞質結構域、單個跨膜結構域和大部分的膠原胞外域組成[24]。膠原蛋白是神經肌肉接頭成熟所需的跨膜蛋白。最近的研究表明膠原蛋白位于神經肌肉接頭的功能區，結合乙酰膽堿酯酶相關膠原蛋白（ColQ），并有助于神經肌肉接頭的乙酰膽堿酯酶的分布形式。因此，我們推測膠原蛋白自身抗體的致病機制可能是阻礙膠原蛋白和其他突觸基底層組分之間的相互作用，并使神經肌肉接頭突觸不穩定[25]。

2 檢測方法

2.1 放射免疫法（radioimmunoprecipiation assay：RIA）

RIA又叫做競爭性飽和法，抗原和抗體由放射性物質標記，隨之結合待檢樣本，形成抗原抗體復合物進行測定。以往的放射免疫測定方法關鍵在于競爭結合特異性抗體，競爭雙方為放射性標記的抗原與待檢樣本中未標記的抗原；另一種方法是在前者的基礎上擴展，關鍵在于放射性物質標記足量抗體，結合待檢抗原，利用固相免疫吸附載體的原理的一種非競爭放射免疫分析法。RIA優勢在于特異性強、靈敏度高、可一次完成大量樣本的檢測、血清的消耗量少。國外研究多采用敏感度和特異度均高的RIA檢測AChR-Ab的滴度[26]，尤其是類似MG癥狀的初步篩選時，RIA應用更廣泛。

2.2 酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA法其本質是一種特異性化學發光反應，優勢在于該方法利用高度特異性抗原抗體結合，可以有效消除樣本的本底和對位量干擾，得到更高的靈敏度。目前，ELISA法可實現全自動化，減少了系統及隨機誤差，因此廣泛應用于MG抗體檢測中。但是，該法易受多方面因素的干擾：①代謝物，測定易出現交叉反應，干擾生物利用度；②抗體的形成，對蛋白的定量測定產生影響；③基質特異性，蛋白的反應性易改變。因此，國內外多推薦利用特異度和靈敏度均高的RIA檢測抗體及其滴度。

2.3 熒光細胞染色方法（cell-based assays，CBA）

CBA原理在于通過編碼蛋白的互補DNA（cDNA）轉染活的人胚胎腎（HEK）細胞，同時與細胞內錨定蛋白rapsyn共同表達，從而使得AChR在HEK細胞表面上表達。測定AChR-Ab時，可用AChR亞基的cDNAs以及rapsyn增強的綠色熒光蛋白轉染HEK細胞。測定LRP4-Ab時，用LRP的cDNAs轉染HEK細胞來增強細胞表面表達。CBA的優勢在于可檢測生物膜環境中的AChR結合的抗體，這些抗體具有天然構象狀態和適當的糖基化水平，與神經肌肉接頭處的抗體類似。因此，CBA可提高血清陰性MG患者的抗體檢測的陽性率。CBA高敏感性很可能是由于其檢測到的抗體通過二價結合使細胞表面上的AChR簇交聯作用，從而增加了CBA檢測抗體的敏感性。但是CBA的劣勢在于，它需使用活細胞，需組織培養設備，成本高，耗時長，目前主要應用于專門的研究中心[27]。

2.4 時間分辨熒光免疫分析法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）

MG患者中AChR-Ab可通過放射免疫沉淀測定，為研究一種非放射性免疫測定法，人們建立了一種鑭系元素的高靈敏度檢測，可標記多種化合物。TRFIA使用Eu3+-a-CTx而不是125I-a-BuTx標記的抗原[28]。其優勢在于用于標記抗原的試劑是比125 I-a-BuTx更穩定，克服了酶不穩定性及RIA中放射性同位素的污染問題，但是，要求專業的實驗設備，限制了該方法的廣泛應用。

MG是臨床少見疾病，同其他自身免疫疾病一樣，其發病的分子機制錯綜復雜，自身抗體與MG的發病機制密不可分，已發現MG相關抗體十余種，是否還存在與MG相關的抗體仍在探索，目前存在許多問題需進一步解決，如自身抗體之間的信號轉導是如何啟動和調節自身免疫應答等，隨著對于MG的深入研究將會有更新的進展；國內外多推薦利用特異度和靈敏度均高的RIA檢測抗體及其滴度，提高檢測抗體的準確性以及擴展檢測方法，從而更好地去認識MG這一疾病。

[參考文獻]

[1] Carr AS，Cardwell CR，Mc Carron PO，et al. A systematic review of population based epidemiological studies in Myasthenia Gravis[J]. BMC Neurology，2010，10（1）：46.

[2] Sieb JP. Myasthenia gravis：An update for the clinician[J].Clinical & Experimental Immunology，2014，175（3）：408-418.

[3] Lindstrom JM，Seybold ME，Lennon VA，et al. Antibody to acetylcholine receptor in myasthenia gravis. Prevalence，clinical correlates，and diagnostic value[J]. Neurology，1976，26（11）：1054-1059.

[4] Hoch W，Mc Conville J，Helms S，et al. Auto-antibodies to the receptor tyrosine kinase MuSK in patients with myasthenia gravis without acetylcholine receptor antibodies[J]. Nature Medicine，2001，7（3）：365-368.

[5] Vincent A. Timeline：Unravelling the pathogenesis of myasthenia gravis[J]. Nature Reviews Immunology，2002，2（10）：797-804.

[6] Koneczny I，Cossins J，Waters P，et al. MuSK myasthenia gravis IgG4 disrupts the interaction of LRP4 with MuSK but both IgG4 and IgG1-3 can disperse preformed agrin-independent AChR clusters[J]. PLoS One，2013，8（11）：e80695.

[7] Higuchi O，Hamuro J，Motomura M，et al. Autoantibodies to low-density lipoprotein receptor-related protein 4 in myasthenia gravis[J]. Annals of Neurology，2011，69（2）：418-422.

[8] Go GW，Mani A. Low-density lipoprotein receptor（LDLR） family orchestrates cholesterol homeostasis[J]. Yale J Biol Med，2012，85（1）：19-28.

[9] Barik A，Lu Y，Sathyamurthy A，et al. LRP4 is critical for neuromuscular junction maintenance[J]. Journal of Ne-uroscience，2014，34（42）：13892-13905.

[10] Liversage AD，Holmes D，Knight PJ，et al. Titin and the sarcomere symmetry paradox11Edited by J. Karn[J]. Journal of Molecular Biology，2001，305（3）：401-409.

[11] Aarli JA，Lefvert AK，Tonder O. Thymoma-specific antibodies in sera from patients with myasthenia gravis demonstrated by indirect haemagglutination[J]. Journal of Neuroimmunology，1981，1（4）：421-427.

[12] Gautel M，Lakey A，Barlow DP，et al. Titin antibodies in myasthenia gravis：Identification of a major immunogenic region of titin[J]. Neurology，1993，43（8）：1581-1585.

[13] Shelly S，Agmon-Levin N，Altman A，et al. Thymoma and autoimmunity[J]. Cellular and Molecular Immunology，2011， 8（3）：199-202.

[14] 黃載慧，喬健，張祥，等. 血清CAE和Titin抗體檢測對伴胸腺瘤重癥肌無力診斷意義的比較[J]. 上海免疫學雜志，2003，（6）：361-364.

[15] 武茜，顧萍，姚娟，等. 血清AChRab、PsMab和CAEab檢測在胸腺異常患者中的診斷意義[J]. 中國神經免疫學和神經病學雜志，2017，（5）：344-348.

[16] Maruta T，Yoshikawa H，Fukasawa S，et al. Autoantibody to dihydropyridine receptor in myasthenia gravis[J]. Journal of Neuroimmunology，2009，208（1-2）：125-129.

[17] Coronado R，Morrissette J，Sukhareva M，et al. Structure and function of ryanodine receptors[J]. Am J Physiol，1994， 266（6 Pt 1）：1485-1504.

[18] 田雪瑩，于公元. 興奮-收縮偶聯中DHPR與RyR的相互作用[J]. 生命的化學，2007，（5）：413-416.

[19] Suzuki S. Autoimmune targets of heart and skeletal muscles in myasthenia gravis[J]. Archives of Neurology，2009， 66（11）：1334-1335.

[20] Aarli JA. Inflammatory myopathy in myasthenia gravis[J]. Current Opinion in Neurology，1998，11（3）：233-234.

[21] Suzuki S，Satoh T，Sato S，et al. Clinical utility of anti-signal recognition particle antibody in the differential diagnosis of myopathies[J]. Rheumatology，2008，47（10）：1539-1542.

[22] 許博，張臨友，張永強. 自身抗體與重癥肌無力的研究新進展[J]. 國際免疫學雜志，2011，34（5）：276-280.

[23] Meager A. Biological assays for interferons[J]. J Immunol Methods，2002，74（5）：1658-1662.

[24] Tu H，Huhtala P，Lee HM，et al. Membrane-associated collagens with interrupted triple-helices（MACITs）：Evolution from a bilaterian common ancestor and functional conservation in C. elegans[J]. BMC Evol Biol，2015，1（15）：280-281.

[25] Tu Hongmin，Pirskanen-Matell，Ritva Heikkinen，et al. Autoimmune antibodies to collagen in myasthenia gravis patients[J]. Muscle & Nerve，2017，12（5）：201-216.

[26] 李尊波，郭俊，沈定國，等. 放射免疫法定量檢測乙酰膽堿受體抗體與重癥肌無力患者臨床特征的相關性[J].中國神經免疫學和神經病學雜志，2017，（3）：156-161.

[27] Rodriguez Cruz，Huda S，Vincent A，et al. Use of cell-based assays in myasthenia gravis and other antibody-mediated diseases[J]. Experimental Neurology，2015，32（270）：66-71.

[28] Jacob S，Viegas S，Leite MI，et al. Presence and pathogenic relevance of antibodies to clustered acetylcholine receptor in ocular and generalized myasthenia gravis[J]. Archives of Neurology，2012，69（8）：994-1001.

（收稿日期：2017-12-21）