發根農桿菌菌株和花生品種對發根誘導率的影響

任艷 李雙鈴 尹亮 崔瀟 李磊 石延茂 袁美

摘要：試驗以花育20、花育45、魯花11無菌花生子葉為材料，采用3×3雙因子設計，研究3株發根農桿菌菌株和花生品種對花生發根誘導率的影響。結果表明：發根農桿菌和花生品種均顯著影響發根誘導率。花育45的發根誘導率最高，為93.7%，其適宜菌株為A4；花育20的發根誘導率為89.2%，適宜菌株為ATCC15834；魯花11的發根誘導率為73.4%，適宜菌株為GIM1.141。

關鍵詞：發根農桿菌；發根；誘導率；花生品種

中圖分類號：S565.2：S154.39文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）03-0103-04

Abstract Three Agrobacterium rhizogenes strains on the induction rate of hairy roots of peanut were investigated by 3×3 double-factor design with the cotyledon of sterile plantlets of Huayu 20， Huayu 45， Luhua 11 as meterials. The results showed that both Agrobacterium rhizogenes and peanut varieties significantly affected the induction rate of hairy roots. Huayu 45 had the highest induction rate of 93.7%， and its appropriate strain was A4. The hairy roots induction rate of Huayu 20 was 89.2%， and the suitable strain was ATCC15834. The hairy roots induction rate of Luhua 11 was 73.4%， and its fitting strain was GIM1.141.

Keywords Agrobacterium rhizogenes； Hairy roots； Induction rate； Peanut varieties

發根是整個植株或植株的某一器官、組織（包括愈傷組織）單個細胞甚至原生質體受發根農桿菌的感染所產生的一種病理現象[1]。發根農桿菌能夠感染大多數雙子葉植物和少數單子葉植物，并在感染部位產生大量生長迅速、多分支的發根[2]。發根的誘導是發根農桿菌Ri質粒上T-DNA基因轉移到植物細胞并表達的結果[3]。發根起源于單個細胞，具有生長迅速、遺傳穩定、有利于篩選高效表達克隆等特點[4]。發根轉化體系的建立與發根農桿菌菌株有關，不同農桿菌的Ri質粒對不同植物、同一植物不同部位以及同一植物同一部位不同發育階段的外植體有不同的敏感性；植物本身的基因型以及植物細胞受傷后的生理反應、細胞激素水平以及細胞壁結構等因素也和發根轉化體系的建立有很大關系[5，6]。發根培養技術是基因工程和細胞工程相結合的一項技術[7]。

常用的發根農桿菌對花生外植體發根誘導能力存在差異，近年來有關花生發根的研究不少[8-14]，但不同發根農桿菌和花生基因型的組合并不多。本試驗研究發根農桿菌菌株和花生品種對發根誘導率的影響，尋找菌株與品種的最佳組合，建立高效的發根轉化體系，從而獲得大量可在無激素培養基上旺盛生長且遺傳穩定的發根，以期為建立花生發根培養北方根結線蟲體系提供基礎材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花生品種：花育20、花育45、魯花11，均由山東省花生研究所保存。

發根農桿菌：GIM1.141、ATCC15834、A4，其中GIM1.141購自廣東微生物菌種保存中心，ATCC15834、A4均由陜西理工學院保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計及測定指標 采用3×3雙因子完全隨機試驗設計，因子1為發根農桿菌菌株：GIM1.141、ATCC15834和A4；因子2為花生品種：花育20、花育45和魯花11；每個處理30個外植體，重復3次。發根誘導率=產生發根的外植體數/外植體總數×100%。

1.2.2 無菌苗的獲得 分別將3個花生品種的種子在70%乙醇中浸泡1 min，用無菌水清洗1次，然后用0.1%升汞浸泡10 min消毒，再用無菌水沖洗4～5次，每次4～5 min，之后接種在1/2MS0培養基上，于25℃、12 h光周期條件培養， 6～8 d后長出無菌苗。

1.2.3 發根農桿菌菌株的活化與培養 將超低溫（-80℃）保存的3株發根農桿菌分別劃線接種于含100 mg/L卡那霉素（Kan）的YEB固體培養基上，于28℃暗處培養，至長出單菌落。挑取平板上單菌落于10 mL含100 mg/L Kan的YEB液體培養基中， 28℃、黑暗下200 r/min搖床振蕩培養約18 h，搖勻，取0.1 mL活化的菌液加入50 mL 含100 mg/L Kan的YEB液體培養基中進行二次活化，培養至農桿菌液A600值達到0.5～0.8，將菌液3 000 r/min離心3 min后棄上清，用50 mL MS0液體培養基懸浮，即獲得侵染菌液。

1.2.4 外植體的轉化及發根的誘導 在超凈工作臺上，將花生無菌苗的子葉切成0.3～0.5 cm小塊，并在外植體表面輕劃幾處傷口，置于侵染菌液中浸泡10～15 min后取出，倒掉菌液，用無菌濾紙吸干多余菌液，接種于MS0培養基上，于黑暗條件下培養2 d，后轉接到5MS0培養基〔含500 mg/L頭孢霉素（Cephalosporin，簡寫Cel）〕上培養3～5 d，再轉至3MS0抑菌培養基（含300 mg/L Cel）上培養。每7～8 d轉接1次，30 d后統計誘導發根數并計算發根誘導率。

1.2.5 除菌篩選培養 將生長粗壯、約5～6 cm長的發根切下，放入篩選培養基（含30 mg/L Kan+300 mg/L Cel）中，7～8 d后選正常生長的根放入1MS0培養基（含100 mg/L Cel）上，每7～8 d轉接1次，繼代3次后轉接至MS0培養基（不含抗生素）中培養。篩選生長快、長勢好的發根，取該發根進行擴繁培養。

1.2.6 繼代培養 待篩選出的發根培養20～30 d出現老化現象時，將長勢較好、未出現老化的末端發根剪下，每段大于3 cm，轉入新的MS0培養基（不含抗生素）中。

1.2.7 Ri質粒轉化的判斷 根據3項重要生物學特性初步判斷Ri質粒轉化情況：發根的發生多在母體植物的不定部位，發根表現為較弱的向地性，發根在無激素的培養基上能夠正常快速地生長[15]。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2003和DPS 7.05對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 發根農桿菌對花生子葉的誘導培養

試驗結果表明，3個品種花生子葉經發根農桿菌侵染后，微小的愈傷組織出現在子葉切口處，7～9 d后從切口處產生發根（圖1A），發根多發生在母體植物的不定部位。3株發根農桿菌菌株均可誘導花育20、花育45、魯花11的品種子葉外植體產生發根。發根切下后可在MS0培養基（不含抗生素）上獨立生長（圖1B），表現為較弱的向地性。15～20 d后發根布滿整個培養皿（圖1C），在無激素的培養基上能夠正常快速地生長。從形態角度初步判斷發根Ri質粒轉化成功。

2.2 發根農桿菌菌株和花生品種對發根誘導率的影響

從表1可知，發根農桿菌菌株和花生品種都顯著影響發根誘導率。不同花生品種平均發根誘導率為：花育45>花育20>魯花11。3株發根農桿菌菌株在花育45平均發根誘導率為85.5%，花育20為82.4%，魯花11為57.1%，花育45的平均發根誘導率是魯花11的1.5倍；不同發根農桿菌菌株平均發根誘導率為：A4>GIM1.141>ATCC15834。GIM1.141菌株在3個花生品種的平均發根誘導率為76.7%，A4為77.1%，ATCC15834為71.2%，A4菌株的平均發根誘導率是ATCC15834的1.08倍；可見，花生品種影響發根誘導率的作用要高于發根農桿菌菌株的作用。同時花生品種和發根農桿菌存在顯著交互作用。花育45的適宜發根農桿菌菌株為A4，發根誘導率為93.7%；花育20的適宜發根農桿菌菌株為ATCC15834，發根誘導率為89.2%；魯花11的適宜發根農桿菌菌株為GIM1.141，發根誘導率為73.4%。

3 討論與結論

本試驗利用不同發根農桿菌轉化不同花生品種子葉外植體，均獲得了激素自主、多分支、多根毛、在無激素的MS0培養基上快速生長的發根，且誘導率相對較高。在鑒別方法上，可以從形態學角度判斷發根[16]。試驗所用的3株發根農桿菌菌株均屬農桿堿型，T-DNA具有不連續性，有兩個邊界區域，即TL-DNA和TR-DNA。TL-DNA上存在與根的形態有關的基因[17]。TR-DNA上有生長素合成基因tms1和tms2，指導吲哚-3-乙酸（IAA）的合成，因此轉化產生的發根在培養時不需要添加外源生長素，為激素自養型[18]。當T-DNA整合到植物基因組中，產生對生長素敏感度比普通根強100～1 000倍的負向地性的發根[19]。本試驗獲得的發根為激素自養型，且表現明顯負向地性，說明T-DNA成功整合到植物基因組中。

研究表明，發根農桿菌遺傳轉化效率受到菌株種類、寄主植物種類和培養條件的影響，特別是植物基因型是公認的影響農桿菌轉化效率的主要限制因素[20]，說明品種的選擇是建立高效發根誘導體系和培養體系的關鍵因素，本試驗結果也證實了這一點。發根農桿菌菌株影響花生發根誘導率，可能是由于發根農桿菌的致根特性與其所帶Ri質粒的類型有關[21]。花育45、花育20和魯花11的最適宜發根農桿菌菌株分別為A4、ATCC15834和GIM1.141。以上結果可為建立花生發根培養體系奠定基礎。

參 考 文 獻：

[1] David C， Petit A， Tempe J.T-DNA length variability in mannopine hairy root： more than 50 kilobasepairs of pRi T-DNA can integrate in plant cells[J]. Plant Cell Reports，1988，7（2）：92-95.

[2] Toivonen L.Utilization of hairy root cultures for production of secondary metabolites[J]. Biotechnol. Prog.，1993，9（1）：12-20.

[3] Hayman T G， Farrand S.Agrobacterium plasmids encode structurally and functionally different loci for catabolism of agrocinopine-type opines[J]. Molecular and General Genetics，1990，223（3）：465-473.

[4] Mcknight T D， Lillis M T， Simpson R B.Segregation of genes transferred to one plant cell from two seperate Agrobacterium strains[J]. Plant Molecular Biology，1987，8（6）：439-445.

[5] 曹冬梅，韓振海，許雪峰.發根農桿菌Ri質粒研究進展[J].中國生物工程雜志，2003，23（2）：74-78.

[6] 姜伊娜，武天龍.毛狀根的研究進展及應用[J].中國農業科技導報，2009，11（1）：27-32

[7] 李用芳，周延清.發根農桿菌及其應用[J].生物學雜志，2000，17（6）：29-31.

[8] Medina-Bolivar F， Condori J， Rimando A M， et al.Production and secretion of resveratrol in hairy root cultures of peanut [J].Phytochemistry，2007，68（14）：1992-2003.

[9] Kim J S， Lee S Y， Park S U. Resveratrol production in hairy root culture of peanut， Arachis hypogaea L. transformed with different Agrobacterium rhizogenes strains[J].African Journal of Biotechnology，2008，7（20）：3785-3787.

[10]Karthikeyan A， Palanivel S， Parvathy S， et al. Hairy root induction from hypocotyl segments of groundnut（Arachis hypogaea L.）[J]. African Journal of Biotechnology，2007，6（15）：1817-1820.

[11]姚慶收，武玉永，王學全.發根農桿菌介導的花生遺傳轉化體系的建立[J].安徽農業科學，2008，36（35）：15367-15368.

[12]任艷，李磊，崔瀟，等.發根農桿菌誘導花生發根的條件優化[J].核農學報，2012，26（3）：439-443.

[13]劉杰， 任艷， 張宗申，等. 花生毛狀根誘導及其體外培養[J]. 安徽農業科學， 2012，40（6）：3229-3233.

[14]任艷，江晨，王輝，等.不同發根農桿菌誘導花生發根研究[J].山東農業科學，2015，47（1）：14-16.

[15]張蔭麟，呂桂蘭，周新華，等.金蕎麥發狀根培養的研究[J].植物學報：英文版，1992，34（8）：603-608.

[16]Giri A， Narasu M L. Transgenic hairy roots： recent trends and applications[J].Biotechnology Advances， 2000，18（1）：1-22.

[17]White F F， Taylor B H， Hhffman G A， et al. Molecular and genetic analysis of the transferred DNA regions of the root-inducing plasmid of Agrobacterium rhizogenes[J].Journal of Bacteriology，1985，164（1）：33.

[18]Spena A， Schmulling T， Konca C， et al. Independent and synergistic activity of rol A，B and C loci in stimulating abnormal growth in plants[J]. EMBO Journal，1987，6（13）：3891-3899.

[19]Shen W H ， Petit A， Jean G， et al. Hairy roots are more sensitive to auxin than normal roots[J]. PNAS，1988，85（10）：3417-3421.

[20]Sadiye H， Aynur G， Ismail H A， et al. Induction of Gentiana cruciata hairy roots and their secondary metabolites[J].Biologia，2011，66（4）：618-625.

[21]李勝，楊德龍，李唯，等.植物試管苗離體生根的研究進展[J].甘肅農業大學學報，2003，38（4）：373-384.