漳州紫泥圍墾區海水中弧菌類群研究

陳明霞，鄭計瑞，李和陽

(1.華僑大學化工學院，福建廈門 361021；2.國家海洋局第三海洋研究所，福建廈門 361005)

弧菌作為近海、河口環境中微生物區系的主要成員，廣泛分布于自然水域及漁業生物中，是引發人類細菌性疾病的主要病原之一。人們通過飲用不潔水，食用未加工或未加工熟的帶有致病弧菌的食物，特別是海產品而感染發病[1-4]。近年來，海水養殖業的快速發展，加快了海水生境的破壞，養殖環境不斷惡化，使養殖動物病害不斷發生。弧菌病(Vibriosis) 主要是由弧菌屬(Vibrio)細菌引起的一類細菌性疾病，也是海水養殖動物主要的細菌病害之一。已知海水養殖動物弧菌病病原菌超過20種，危害到魚類、貝類及甲殼類中各種養殖動物，不僅給養殖業造成巨大的經濟損失[5]，而且導致野生海水動物大量死亡，進而導致食用人員腸道疾病或食物中毒。弧菌病相關病原的研究已經成為養殖病害及養殖環境治理的主要研究領域之一。

福建省漳州龍海市東北部的紫泥鎮，地處福建省第二大河九龍江出海口，屬于咸淡水交匯處，水質較好，水產養殖發達。紫泥圍墾區是其中重要的海水養殖區域，同樣存在著養殖環境惡化及水產致病菌嚴重等問題。筆者采用傳統的TCBS培養基分離篩選菌株及分子鑒定方法，對該養殖區域的弧菌類群進行分析，探討該養殖區潛在的弧菌病病原菌種類及其可能的風險。

1 材料與方法

1.1樣品采集海水樣品采集點位于福建漳州龍海紫泥圍墾區養殖區域的01站位(117.908 916°E，24.448 861°N)，03站位(117.906 578°E，24.449 108°N)和06站位(117.907 878°E，24.446 680°N)，樣品采集時間為2011年2月。

1.2培養基2216E和TCBS培養基(Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose)參考文獻[6]中描述。

1.3弧菌的分離培養將01、03、06這3個站位的海水樣品進行梯度稀釋，得到100、10-1、10-2共3個樣品梯度，每個梯度分別取200 μL于TCBS瓊脂平板上，涂布均勻，于25 ℃培養箱培養；每個梯度做2個重復。隨機挑取分離良好的48個菌落接種于2216E 瓊脂平板上，盡可能保證挑取到所有的菌落類型。對所分離的菌株在2216E 平板上進行3次以上純化，以保證得到純培養物。

1.4弧菌的鑒定對所分離得到的TCBS菌株進行16S rRNA基因-RFLP酶切譜型分析，挑選各RFLP譜型代表菌，通過16S rRNA基因序列比對及系統發育分析進行菌種分子鑒定，16S rRNA 基因的PCR擴增及酶切分析方法參考文獻[7-8]中描述。菌株16S rRNA基因序列由南京金斯特生物技術有限公司測定，所得序列校正后在EzBioCloud數據庫比對分析并獲取相近菌種的16S rRNA基因序列。利用DNAman(version 5.1，Lynnon BioSoft)軟件進行序列同源性分析及構建16S rRNA基因系統進化樹。

2 結果與分析

2.1弧菌16SrRNA基因-RFLP分析不同樣品在TCBS培養基上生長的菌落皆屬于典型的黃色或綠色，隨機挑取48個菌落(盡可能包括所有不同菌落類型)，純化后，使用細菌通用引物27F和1492R對所分離的48個菌株進行16S rRNA基因-PCR擴增(圖1)，用AfaI和MspI限制性內切酶對48個菌株16S rRNA基因擴增片段進行雙酶切并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(RFLP分析)。結果表明，48個菌株可分為6種不同的RFLP分子譜型(Ⅰ～Ⅵ)，每種RFLP譜型挑出1個代表菌株進行16S rRNA基因的序列及系統發育學分析。

注：M.DL 2000;1～15.紫泥圍墾區06站位菌株編號Note:M.DL2000;1～15.Strains numbers of station 06 of Zini marine aquaculture area圖1 部分弧菌菌株16S rRNA基因PCR擴增結果Fig.1 16S rRNA gene PCR amplification results of some Vibrio strains

2.2弧菌16SrRNA基因序列及系統發育學分析對6個代表菌株進行16S rRNA基因的序列比對鑒定(表1)及系統發育分析(圖2)，6個菌株屬于4種弧菌。Ⅰ型代表菌株JR-5和Ⅱ型代表菌株JR-12屬于同一個物種(group 1)，與V.crassostreaeLGP7T(大黃魚弧菌)、V.celticusRd 8.15T(凱爾特人弧菌)、V.gigantisCAIM 25T(牡蠣弧菌)的16S rRNA基因序列相似度皆為100.00%，無法區分，但從系統發育樹上明顯可見菌株JR-5、JR-12與V.crassostreaeLGP7T距離更為接近，處在一個小分支上；Ⅲ型代表菌株JR-10和Ⅳ型代表菌株JR-19屬于同一個物種(group 2)，與V.atlanticusVb 11.11T(大西洋弧菌)、V.tasmaniensisLMG 21574T(塔斯馬尼亞弧菌)皆有99%以上的同源性，但系統發育樹分析顯示菌株JR-10、JR-19與V.atlanticusVb 11.11T具有更近的親緣關系；Ⅴ型代表菌株JR-15與V.splendidusATCC 33125T(燦爛弧菌)有99.85%的同源性，為group 3；VI型代表菌株JR-20與V.lentus4OM4T(緩慢弧菌) 有98.60%的同源性，為group 4。不同弧菌類群所占比例不同，group 2 占有58.3%，具有絕對的優勢，其他3類比例相當：group 1和4各占14.6%、group 3占12.5%。

3 討論

紫泥圍墾區屬于海水養殖區域，鹽度相對較高，以TCBS培養基分離獲取的菌株100%為弧菌，不包含有其他非弧菌TCBS類群，該結果與陳明霞等[6]、李和陽等[9]研究結果相符，TCBS培養類群中弧菌所占的比例與鹽度息息相關。

表1 不同RFLP譜型代表菌株16S rRNA基因序列系統關系分析結果

注：結點處數字表示Bootstrap 1 000 次重復檢驗的自舉值(僅顯示高于50%的數值；括號中為每個16S rRNA基因序列的登錄號；比例尺代表每100 bp 5個堿基替換數Note:The bootstrap values above 50% from 1 000 replicates are shown.The accession number of each 16S rRNA gene sequence is given in parenthesis.The scale bar represents 5 substitutions per 100 bp圖2 根據16S rRNA基因序列構建的紫泥圍墾區海水弧菌代表菌株系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of representative Vibrio strains from Zini marine aquaculture area based on bacterial 16S rRNA gene

根據Drancourt 等[10-11]提出16S rRNA基因序列同源性鑒定規則及相關的系統進化樹分析，紫泥圍墾區主要的弧菌類群有4類，分別為group 1-V.crassostreae；group 2-V.atlanticus；group 3-V.splendidus和group 4-V.lentus。其中V.crassostreae和V.atlanticus至少含有2種類型的16S rRNA基因拷貝，因此具有2個的RFLP譜型。這4類弧菌都屬于專性需鹽細菌，是海水或咸水養殖水體的重要弧菌成員。

弧菌屬包含100多個不同物種，分屬于14個進化分支[12]，紫泥圍墾區的4種弧菌類群皆屬于V.splendidus進化分支[13-15]。V.splendidus可引起魚類、對蝦和牡蠣的疾病[5]；V.crassostreae于2004年分離自生病的長牡蠣(Crassostreagigas)血淋巴[13]，是長牡蠣的條件致病菌[16]；V.atlanticus最早分離自海灣扇貝(Ruditapesphilippinarum)[15]，目前并無實例證明該菌屬于致病菌[12]，但其近似種V.tasmaniensis卻被報道可以引起柳珊瑚疾病[17]；V.lentus可引起野生章魚(Octopusvulgaris)疾病[18]，其對養殖生物同樣具有嚴重威脅。

據調查，許多養殖戶會自購現成的TCBS培養基平板進行弧菌的分離培養，并通過觀察菌落的顏色和數量以判斷可能潛在的副溶血弧菌(V.parahemolyticus)病害危機，這顯然并不科學而且經常會背道而馳。該研究明確了特定時間段內紫泥圍墾區弧菌的類群組成，即該區域的弧菌主要為V.splendidus相關種類，對于針對性地防控這些弧菌引起的養殖動物疾病具有一定的指導價值。

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