電針對失神經大鼠骨骼肌自噬相關基因表達的影響

吳夢佳，唐成林，趙丹丹，羅翱，安薈羽，譚程方，邱麗

1.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶市400016；2.中醫藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室，重慶市400016

周圍神經損傷后，失神經支配的骨骼肌發生快速萎縮，肌蛋白分解率增加，骨骼肌質量迅速下降，極大影響骨骼肌功能的維持和恢復[1]。失神經骨骼肌萎縮發生時，自噬相關基因活性升高[2]。自噬-溶酶體系統通過調控骨骼肌細胞的代謝和穩態，對維持骨骼肌質量的穩定發揮重要作用[3]。臨床研究表明，針灸對骨骼肌萎縮的治療效果顯著[4]；電針能有效延緩失神經大鼠骨骼肌萎縮，但其具體機制仍有待明確[5]。本課題組前期研究表明，電針能通過上調失神經肌萎縮大鼠模型中胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)的表達、下調肌肉生長抑制素(myostatin)的表達，促進肌衛星細胞的增殖[6]；并上調Bcl-2的表達，下調caspase-3等凋亡相關因子的表達[7]，從而延緩失神經骨骼肌萎縮。本研究觀察電針對失坐骨神經大鼠腓腸肌中自噬相關基因(autophagy-related gene,Atg)表達的影響，從肌萎縮后自噬活性水平的角度，探討電針延緩失神經骨骼肌萎縮的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

8周齡清潔級健康雄性Sprague-Dawley大鼠21只，體質量270～290 g，重慶醫科大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號SCXK(渝)2012-0002。飼養于SPF級動物房。

大鼠適應性喂養7 d后，將大鼠編1～21號，使用計算機自動生成21個兩位數隨機數字，每個編號對應一個隨機數字，將隨機數字從小到大依次排列序號，其中序號1～7為假手術組，8～14為模型組，15～21為電針組。實驗過程中動物處置均按照重慶醫科大學倫理委員會標準進行。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol總RNA提取試劑盒、RR037A逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq TMII、ULK1、Atg13、Beclin1、Atg14、Atg7、Atg12、Atg5、Atg16L1、GAPDH引物合成：TAKARA公司。

SDZ-Ⅱ型電子針治療儀：蘇州醫療用品有限公司。漢醫牌無菌針灸針：北京漢醫醫療器械中心。柔軟型實驗大鼠固定器：溫州原上草醫療科技有限公司。AL204型電子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司。低溫高速離心機：日本SIGMA公司。Thermo ND 2000超微量核酸蛋白測定儀：上海GENE公司。CFX PCR檢測系統、T100TMPCR儀：美國BIO RAD公司。CellSens Standard圖像采集軟件、BX53普通正置顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 造模方法

制備切斷大鼠坐骨神經腓腸肌萎縮模型[8]。大鼠4%水合氯醛8 ml/kg腹腔注射麻醉，俯臥固定于手術臺，無菌條件下右后肢手術區備皮。于大鼠右后肢坐骨結節下緣外側切口6～8 mm，玻璃分針沿肌肉走向鈍性分離肌肉與筋膜，找到并暴露坐骨神經；取中段切斷，造成1.0 mm神經缺損。逐層縫合肌肉與皮膚，清潔傷口。

假手術組只暴露神經，不行坐骨神經截斷術。

1.4 電針干預

造模1 d后，用大鼠固定器[9]固定電針組大鼠，選右側足三里、環跳穴[10]，使用直徑0.25 mm、長13 mm針灸針，直刺5～7 mm；接電針儀，正極連接足三里，負極連接環跳，連續波，強度1.0 mA，頻率2 Hz，以大鼠下肢稍震動為宜，每次10 min，每天1次，每周6次，連續干預8周。

假手術組和模型組每天同法固定，但不進行電針干預。

1.5 標本采集

各組大鼠于造模后8周取材。大鼠4%水合氯醛8 ml/kg腹腔注射麻醉，無菌條件下完整剝離雙側腓腸肌，去除多余肌腱頭，PBS冷浴；吸干表面殘留液體。術側腓腸肌組織分為兩份，一份快速修剪后置4%多聚甲醛中固定，用于形態學檢測；一份錫箔紙包裹，放入液氮罐中速凍，-80℃冰箱保存待測。

1.6 檢測方法

1.6.1 腓腸肌濕重比

大體觀察雙側腓腸肌大小。觀察后迅速完整剝離雙側腓腸肌，將多余血管及神經清除，于電子天平上稱取肌濕重，以健側作為對照，計算腓腸肌濕重比。

1.6.2 腓腸肌纖維截面積及直徑

腓腸肌4%多聚甲醛固定后，蔗糖梯度脫水3 d，OTC包埋，制備厚8 μm冰凍切片。晾干，行HE染色，過二甲苯溶液2次，每次5 min；梯度乙醇浸泡4次，每次2 min，清水沖洗2 min；蘇木素染色2 min，沖洗；浸于分化液中40 s，沖洗；伊紅染色80 s，沖洗；梯度乙醇浸泡2次，每次2 min；二甲苯溶液浸泡4 min；樹膠封片，晾干。200倍光學顯微鏡下觀察切片，每張切片隨機選取5個視野拍照，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算腓腸肌纖維截面積和直徑。

1.6.3 逆轉錄實時定量聚合酶鏈反應

腓腸肌組織樣本約50 mg，提取組織上清，將Trizol液加入管中，剪碎組織，充分勻漿，離心，提取總RNA；異丙醇沉淀后離心，75%乙醇清洗3次后晾干，加入無酶水待檢。清洗超微量核酸蛋白測定儀探頭3次，記錄總RNA 260/230和260/280值，計算稀釋比例。-20℃取出SYBR Green，按說明書配制反應體系，合成反應體系，設置反應條件行逆轉錄：37℃15 min，85℃5 s，4℃+∞。加樣，標板后上機行定量聚合酶鏈反應。使用CFX Manager 3.1軟件讀取Ct值，計算2-△△Ct。上下游引物序列見表1。

1.7 統計學分析

采用SPSS 22.0統計軟件進行分析。實驗結果均用(xˉ±s)表示，采用單因素方差分析；方差齊時，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗，方差不齊時采用Dunnett's T3檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 腓腸肌濕重比

與假手術組相比，模型組和電針組術側腓腸肌濕重比顯著降低(p＜0.001)，電針組高于模型組(p＜0.05)。見表2。

2.2 形態學

假手術組肌纖維邊緣規則，形態正常；模型組肌纖維縮小，邊緣不規則；電針組較模型組肌纖維大且邊緣較規則。見圖1。與假手術組相比，模型組和電針組術側腓腸肌纖維截面積和直徑顯著降低(p＜0.001)，電針組顯著高于模型組(p＜0.001)。見表2。

表1 待測基因引物序列

2.3 聚合酶鏈反應

與假手術組相比，模型組術側腓腸肌ULK1、Atg13、 Beclin1、 Atg14、 Atg7、 Atg12、 Atg5 和Atg16L1 mRNA表達顯著升高(p＜0.001)；與模型組相比，電針組以上mRNA表達量均下降(p＜0.05)。見表3。

3 討論

根據靶器官肌肉損傷后的臨床特征，失神經骨骼肌萎縮屬傳統中醫學“痿癥”范疇，主要表現為肌肉瘦削、酸困且痿軟無力[11]。據“治痿獨取陽明”的理論，選取足陽明胃經合穴足三里穴，以強筋健骨，補益氣血；局部取足少陽膽經環跳穴，以通經活絡，便利腰腿。尚畫雨等[12]發現，針刺大鼠腓腸肌可有效下調大負荷運動后腓腸肌中Pink1和Parkin的表達，抑制線粒體自噬過度激活，減輕骨骼肌損傷，促進修復。提示電針延緩骨骼肌萎縮的治療作用可能與調節骨骼肌細胞自噬活性有關。

圖1 大鼠術側腓腸肌纖維病理學改變(HE染色，bar=100 μm)

表3 各組大鼠自噬相關基因表達比較(2-△△Ct)

自噬-溶酶體系統是控制骨骼肌蛋白質代謝的重要途徑之一[13]，在肌肉體積控制及維持細胞自身穩態方面發揮重要作用[14]。自噬過程大致分為4個階段：自噬誘導、自噬體形成、自噬溶酶體形成和內容物降解；自噬相關基因參與細胞自噬的全過程，發揮著重要作用[15]。ULK1是酵母Atg1在哺乳動物的同源基因，與調節成分Atg13共同構成復合物，增強Atg13穩定性，在自噬誘導階段起關鍵作用[16]。Beclin1是酵母Atg6在哺乳動物的同源基因，與調節成分Atg14等參與小囊泡形成，其表達強度與自噬活性密切相關[17]。Atg5和Atg12是影響自噬體泛素樣蛋白修飾的重要基因[18]，其形成的復合體在自噬體膜的延伸過程中發揮重要作用，促使自噬小體不斷形成。Atg7是輔助自噬體伸展擴張的重要基因。在自噬體形成期，Atg7通過水解ATP獲能，進而激活Atg12，在Atg10的催化下，Atg12與Atg5結合，進而募集Atg16L1形成多聚復合體，有利于自噬體的伸展擴張[19]，促進自噬活性增強。

李妍等[20]在慢性阻塞性肺疾病大鼠模型中發現，在萎縮的骨骼肌組織中，FoxO轉錄因子及自噬相關因子Beclin1、Atg5、Bnip3等升高，自噬-溶酶體系統被激活，骨骼肌萎縮加重；敲除小鼠Atg7以抑制自噬，也出現肌力下降、肌肉萎縮，并沒有出現維持肌肉穩態的結果[21]；而Laminin-2自噬缺陷小鼠出現肌萎縮和營養不良等癥狀，卻是由于自噬過度激活所致[22]。有研究表明[23]，胰島素缺乏的糖尿病大鼠骨骼肌中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)受到抑制，FoxO3被激活，導致自噬過度激活，骨骼肌發生萎縮，肌肉流失。耐力運動可以激活mTOR，降低自噬水平，減輕自噬過度激活，從而減少蛋白質等的過度降解，維持骨骼肌穩態[24]。Liu等[25]研究發現，KLHL20可以通過調控ULK1和Vps34復合物的代謝，控制自噬的終結，防止因過度自噬引起的肌肉損失。Sato等[26]發現，賴氨酸可減少C2C12肌管細胞中肌纖維蛋白的降解，延緩肌肉萎縮，其機制可能是通過激活mTOR，抑制自噬溶酶體系統活性的過表達。以上研究提示，自噬水平的高低與骨骼肌細胞穩態的維持緊密相關，不足或過度的自噬都不利于骨骼肌健康，自噬過程的關閉和防止自噬過度激活，對保持肌肉結構穩態，防治肌肉萎縮意義重大。

臨床治療時，由于不能及時到找適合的神經供體進行移植，等待手術的過程往往又比較漫長，不可逆的失神經肌萎縮將得以持續。維持骨骼肌細胞穩態，保持其相對活性，延緩骨骼肌萎縮是進行神經移植手術，提高移植后骨骼肌適應性的關鍵。本研究表明，失坐骨神經8周后，大鼠腓腸肌中自噬相關基因表達上調，自噬活性增強；電針干預后自噬活性下降，骨骼肌萎縮減輕。這一結果與其他研究團隊通過手針、運動、藥物等干預方式的研究結果一致[12,24-25]，可為臨床進行神經移植術、提高神經移植后骨骼肌功能恢復，爭取寶貴的治療時間。

自噬作為一種自我調節機制，在機體中發揮著“雙刃劍”的作用[27]。針灸具有調節陰陽平衡的作用。在失神經1周和4周時，電針可通過上調自噬相關基因表達，促進坐骨神經修復[28]。因此，在較長時間失神經過程中，自噬對于萎縮骨骼肌的具體影響，以及電針如何對其進行調控以延緩失神經肌萎縮的具體機制，還有待進一步研究說明。

綜上所述，我們推測，電針延緩大鼠失神經骨骼肌萎縮的機制可能是通過調控自噬相關基因的表達，影響肌萎縮的自噬活性，抑制自噬水平過度激活，從而維持肌細胞穩態來實現的。

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