兩種體系下誘導多潛能干細胞定向分化為運動神經元前體細胞的差異

李哲，方明珠，陳紅，郭鋼花，范家宏，毛志娟

1.鄭州大學第五附屬醫院，河南鄭州市450052；2.華中科技大學同濟醫院，湖北武漢市430030

人誘導多潛能干細胞(human-induced pluripotent stem cells,iPSCs)是將特定的多能遺傳基因導入體細胞獲得的一種類似胚胎干細胞的多能干細胞。相比于胚胎干細胞，iPSCs來源充足，并具有疾病特異性，在多種疾病，如心血管疾病[1]、脊髓損傷[2]、腦卒中[3-4]、神經退行性疾病[5-6]等的研究和治療中，具有廣泛潛能。

運動神經元病是一種選擇性侵犯大腦皮層、腦干和脊髓運動神經元的神經退行性疾病，病因不明，目前尚無有效治療手段。肌萎縮側索硬化癥為最常見的神經退行性疾病，針對該病的細胞療法已進入臨床前期實驗，如利用患者體內間充質干細胞(NCT：02917681、02290886、01609283、02881489)和神經干細胞(NCT：02943850、01730716)的移植，利用患者來源iPSCs建立疾病特異性細胞庫(NCT：00801333、02574390、00874783)以進行機制研究。在實驗室研究中，利用iPSCs分化為特定類型的神經細胞，建立體外細胞[5]或動物模型[7-8]為目前研究熱點。

培養iPSCs關鍵在于維持其未分化及無限增殖的特性，主要為有飼養層培養和無飼養層培養兩種方法。有飼養層培養將iPSCs與飼養層細胞共培養，通過飼養層細胞產生的多種因子，維持iPSCs的增殖，且保持其核型正常。但有飼養層培養需頻繁制備飼養層細胞以支持iPSCs生長，增加了體外培養的工作量，且飼養層細胞本身可能攜帶及分泌異源性物質，所培養的干細胞可引發人體免疫排斥，不適于臨床應用[9-10]，因此無飼養層培養方法逐漸興起。

無飼養層培養使用細胞外基質促進細胞貼壁，用添加細胞因子的限定性培養基維持干細胞生長。無飼養層培養的最大特點是能夠減少或消除飼養層細胞所帶來的干擾。

兩種培養方法均可維持干細胞體外長期增殖[11-12]。但關于不同培養方法干細胞神經分化特性的研究仍較少，而誘導iPSCs獲得高純度神經細胞是臨床及基礎研究中的關鍵步驟。本實驗利用有飼養層及無飼養層培養方法，結合Du等[13]的脊髓運動神經元分化方案，利用不同小分子組合，經誘導iPSCs 12 d，定向分化為特定類型的神經前體細胞——脊髓運動神經元前體細胞(motor neuron precursor cells,MNP)，并在比較兩種體系中的分化效率，為后期優化分化方案提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

iPSCs株由健康成年人外周血通過仙臺病毒重編程獲得。孕13.5 d CF1小鼠購自上海斯萊克公司。

DMEM/F12、Neurobasal、Knockout血清替代物(Knockout serum substitute,KSR)、N2添加劑、B27添加劑、GlutaMAX、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、非必需氨基酸(nonessential amino acids,NEAA)、L-谷氨酰胺、胰酶：GIBCO公司。mTeSR1培養基：STEMMCELL公司。DMEM高糖：HYCLONE公司。β-巰基乙醇、抗壞血酸(ascorbic acid，AA)、Dispase、明膠、兔來源HOXA3多克隆抗體：SIGMA公司。重組人堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)：PEPROTECH公司。山羊來源SOX1、SOX2多克隆抗體：RNDSYSTEMS公司。兔來源OLIG2多克隆抗體：MILLIPORE公司。兔來源OCT4抗體：CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。兔來源PAX6抗體：BIOLEGEND公司。二抗均為INVITROGEN公司產品。CHIR99021(CHIR)、DMH1：TORCRIS 公 司 。SB431542(SB)、視 黃 酸 (retinoic acid,RA)、 Purmorphamine(Pur)：STEMGENT公司。熒光顯微鏡：NIKON公司。

1.2 飼養層細胞的制備

取出孕鼠宮內胎鼠，分離全層皮膚組織，用鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)培養基制成單細胞懸液，接種至培養瓶中作為P0細胞。細胞長至80%左右匯合時，1∶3傳代。收集對數生長期P6～P10細胞，送輻照中心行γ射線照射。具體制備方法見參考文獻[14]。飼養層細胞以3.5×105/孔密度接種至體積分數0.1%明膠溶液包被的6孔板中，培養24 h后接種iPSCs。

1.3 iPSCs在有飼養層體系中的培養

有飼養層體系組成如下。①飼養層細胞：γ射線處理后的MEF。②無血清培養基，成分為78%DMEM/F12+10%KSR+1%NEAA+1 mmol/L Gluta-MAX+0.1 mmol/L β-巰基乙醇，使用時加入20 ng/ml bFGF。iPSCs于37℃、5%CO2培養箱內培養，每天換液。根據細胞生長情況，每5～6天用1 mg/ml Dispase消化傳代1次。iPSCs傳代時，需用槍頭刮去分化嚴重克隆，保證iPSCs狀態良好。

1.4 iPSCs在無飼養層體系中的培養

無飼養層體系組成如下：①細胞外基質matrigel；②限定性培養基mTeSR1培養基。傳代前用Matrigel 37℃包被6孔板1 h。選取飼養層上待傳代且狀態良好的iPSCs克隆，機械切割后接種于6孔板中，換為mTeSR1培養基，37℃、5%CO2培養箱內培養，每天換液。每4～5天用1 mg/ml Dispase消化傳代1次。

1.5 MNP細胞的誘導分化

分化過程主要經過以下過程：①iPSCs向神經上皮前體細胞(neuroepithelial progenitors,NEP)分化；②NEP向MNP分化。iPSCs傳代第2天記為分化第0天，加入含有小分子化合物CHIR、DMH1、SB的NEP培養基，誘導細胞向神經化尾側化分化，第6天獲得NEP細胞，表達尾側化神經上皮細胞標記物SOX1、HOXA3；倒置顯微鏡下觀察細胞形態。第6天給予含RA及SHH激動劑Pur的MNP培養基，誘導神經上皮細胞尾側化和腹側化，分化第12天獲得MNP細胞，表達pMN區標記物OLIG2；倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。

分化基礎培養基為47%DMEM/F12+48%Neurobasal+0.5%N2+1%B27+1 mmol/L L-谷氨酰胺+0.1 mmol/L AA；NEP培養基為分化基礎培養基+3 μmol/L CHIR+2 μmol/L SB+2 μmol/L DMH1；MNP 培養基為分化基礎培養基+1 μmol/L CHIR+2 μmol/L SB+2 μmol/L DMH1+0.1 μmol/L RA+0.5 μmol/L Pur。

1.6 實時定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)

收集分化第6天和第12天細胞，Trizol法提取總RNA并測量濃度，定量5 μg進行逆轉錄合成cDNA，并稀釋10倍。以GAPDH為內參，采用SYBR Green Master Mix熒光染料法行RT-qPCR，檢測SOX1、HOXA、PAX6、OLIG2、SOX2、OCT4基因水平。反應條件為95℃預變性10 min，95℃變性30 s，60℃退火 30 s，循環 40 次。所用引物序列見表 1。2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。重復3次，取均值。

表1 RT-qPCR引物序列

1.7 免疫熒光染色及細胞計數

iPSCs在體外培養5代后，行多能性標記物OCT4、SOX2染色；誘導第6天，行SOX1、HOXA3熒光染色；誘導第12天，行OLIG2、OCT4、PAX6熒光染色。

4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.1%Triton-X-100破膜10 min，驢血清室溫封閉1 h，加入適當比例稀釋的一抗：SOX1 1∶500、SOX2 1∶40、HOXA3 1∶1000、 OLIG2 1∶ 500、 OCT4 1∶ 500、 PAX6 1∶1000。濕盒中4℃過夜。12 h后棄一抗，加入適當比例稀釋的二抗：Alexa Fluor 488標記驢抗山羊lgG 1∶1000、驢抗兔lgG 1∶1000；Alexa Fluor 594標記驢抗山羊lgG 1∶1000、驢抗兔lgG 1∶1000。室溫避光處理50 min，加入DAPI核染10 min。甘油封片，熒光顯微鏡下拍照。每組選兩張玻片，每張玻片隨機選5個非重疊視野，行陽性細胞和總細胞計數，計算每張玻片平均陽性細胞率。

1.8 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行數據分析。每組數據來自3次獨立實驗，以(xˉ±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 形態學

在有飼養層體系中，iPSCs呈克隆狀生長，克隆為圓形或橢圓形，邊界清晰；克隆內細胞緊密排列，細胞核大、核仁清晰，核質比較高。無飼養層體系中，iPSCs扁平貼壁生長，形成不規則形細胞克隆；克隆內細胞排列松散，核質比較高。

分化第6天，有飼養層細胞核質比下降，克隆中央細胞堆積增厚，出現早期花環狀結構。無飼養層細胞核質比下降，細胞單層致密生長，無特異性結構。

圖1 兩種體系下培養的iPSCs、NEP和MNP(倒置顯微鏡，100×)

分化第12天，有飼養層細胞呈長梭形，排列成典型玫瑰花環樣結構，細胞呈多層生長，花環中央出現空心結構，花環之間分界清晰。無飼養層細胞同樣出現花環結構，細胞呈單層緊密排列，無明顯立體結構，花環之間分界較模糊。兩種體系下克隆邊緣均有未分化單層細胞殘留。見圖1。

2.2 免疫熒光染色

iPSCs體外培養5代后，均表達多能性抗原SOX2、OCT4(圖2)。分化第6天，細胞均表達NEP標記物SOX1及尾側化標記HOXA3(圖3)。分化第12天，細胞均表達MNP相關標記物OLIG2、PAX6，低表達多能性標記物OCT4(圖4)。有飼養層細胞SOX1、HOXA3、OLIG2陽性細胞率明顯高于無飼養層細胞(p＜0.01)。OCT4表達量均極低，且無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

2.3 相關基因表達

分化第6天，有飼養層培養的NEP細胞SOX1和HOXA3基因表達明顯高于無飼養層(p＜0.01)；分化第12天，有飼養層培養的MNP細胞OLIG2和OCT4表達水平顯著高于無飼養層(p＜0.001)；SOX2和PAX6表達兩組無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

表2 兩組細胞標記蛋白陽性細胞率(%)

圖2 兩種體系下培養細胞多能性抗原表達(免疫熒光染色，200×)

圖3 兩種體系下培養細胞NEP標記抗原表達(免疫熒光染色，200×)

圖4 兩種體系下培養細胞MNP標記抗原及多能性抗原表達(免疫熒光染色)

表3 兩組細胞相關基因表達比較(2-ΔΔCt)

3 討論

iPSCs是可以分化為三個胚層的多潛能干細胞，將其分化為特定區域神經元或神經前體細胞，為目前研究熱點。

通過小分子可逐步誘導iPSCs向特定區域神經元分化。CHIR為Wnt信號激動劑，DMH1和SB分別為骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)及Activin/Nodal通路抑制劑，三者共同作用可誘導細胞向神經尾側化分化，使細胞表達神經發育早期標志物SOX1及尾側化標志物HOXA3。

神經發育過程中，pMN區域產生所有的運動神經元[15]，Pur為SHH通路激動劑，適當濃度可誘導神經上皮向脊髓腹側pMN區神經元分化。OLIG2是脊索腹側pMN區域的重要標記，OLIG2基因敲除后，pMN區域缺失，脊髓運動神經元缺失[16-17]。目前公認OLIG2蛋白為脊髓運動神經元前體細胞特異性標志物。

本研究顯示，兩種體系下iPSCs均能有效分化為MNP，但有飼養層分化效率更高。Gong等[18]報道，飼養層細胞能分泌白血病抑制因子和bFGF等多種生長因子。MEF較其他飼養層細胞可以更好維持胚胎干細胞正常核型[19]，促進神經上皮發生。飼養層細胞作為iPSCs的細胞外基質，也為細胞本身維持和神經發生提供良好微環境，對NEP及MNP的發生起到促進和支持作用。

然而，有飼養層培養體系限制了iPSCs的批量擴增，且引入的動物源性細胞增加免疫排斥風險。Martin等[20]報道，MEF飼養層上培養的人胚胎干細胞可以表達非人源的唾液酸，引起人體免疫應答。目前iPSCs的無異源性培養體系有較多研究[21-23]，如利用人血清衍生蛋白代替飼養層細胞，建立無異源性iPSCs培養體系[24]。然而這些體系中所用的蛋白或細胞來源有限，成本昂貴，不利于細胞批量生產，且各種體系下培養的細胞向特定類型細胞的分化效率需進一步研究。

分化過程中，多能標記蛋白OCT4表達下調，有飼養層MNP中OCT4基因轉錄水平高于無飼養層。OCT4蛋白為細胞多能性標志物，Wnt通路在維持干細胞多能性中發揮重要作用[25]，Wnt經典通路中核心蛋白β-Catenin可增強OCT4的活性[26]。而在飼養層不同的培養條件下，人胚胎干細胞Wnt信號起始狀態存在差異，可能對細胞分化和相關信號通路的研究結果有較大影響[27]。推測兩種體系中Wnt信號通路初始狀態的差異，使有飼養層培養細胞后期OCT4轉錄水平高于無飼養層。

在細胞分化的不同階段加入小分子化合物組合，可以在有飼養層及無飼養層體系中同時獲得特定區域的神經細胞——MNP，且有飼養層體系中分化效率更高。但飼養層細胞增加了后期免疫排斥的概率，不利于細胞移植。無飼養層培養體系減少了異源性細胞的介入，可進行iPSCs的批量擴增及分化。如何利用低或無免疫原性的培養體系獲得大量神經前體細胞，仍需進一步嘗試。

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