加味腦泰方對卵巢摘除腦缺血大鼠海馬細胞外信號調節蛋白激酶1/2和c-Jun氨基末端蛋白激酶蛋白活化的影響

秦莉花，李晟，成邵武，劉林，劉洋，黃娟，龔勝強，程誠，葛金文

1.湖南中醫藥大學，a.中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室；b.護理學院；c.管理與工程信息學院，湖南長沙市410208

缺血性腦卒中是指腦組織局部血流灌注減少或完全中斷，致使腦組織缺血缺氧，導致局限性腦組織壞死的總稱，占腦卒中60%～80%。腦缺血性疾病在全球已成為發病率、死亡率、致殘率極高的疾病，并呈持續增長趨勢[1-2]。腦缺血后發生一系列聯級反應損傷神經細胞，其中神經細胞凋亡是腦缺血造成神經系統損傷的重要機制[3]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路是近年來神經細胞凋亡的熱點之一[4]，其中細胞外信號調節蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)與細胞增殖、凋亡密切相關，ERK也是神經保護的關鍵酶之一[5]。抗凋亡治療成為治療腦缺血的重要方法之一[6]。

腦泰方以補陽還五湯為基礎化裁，臨床已證明具有治療急性腦梗死的作用[7]，動物實驗也證實腦泰方能保護腦缺血再灌注損傷[8]。加味腦泰方在腦泰方基礎上加女貞子、墨旱蓮，具有益氣養陰、化痰活血的功效。本研究用雌性大鼠模型模擬絕經后腦缺血，觀察加味腦泰方對模型大鼠細胞凋亡及ERK1/2、JNK活化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雌性Sprague-Dawley大鼠40只，鼠齡8周，體質量200～240 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號SCXK(湘)2014-0011。動物飼養及動物取材嚴格遵循實驗動物倫理準則和指南相關規定。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗大鼠ERK1/2、JNK、磷酸化ERK(p-ERK 1/2)、磷酸化JNK(p-JNK)一抗：北京博奧森公司。山羊抗兔二抗：北京中杉金橋公司。ECL化學發光試劑盒：GE HEALTHCARE公司。TUNEL試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。冰凍切片機：德國LEICA公司。倒置相差顯微鏡：日本OLYMPUS公司。凝膠成像分析系統：美國BIO-RAD公司。水合氯醛：國藥集團。線栓(2636A4)：北京西濃科技有限公司。

1.3 藥物制備

黃芪20 g、墨旱蓮15 g、女貞子10 g、地龍10 g、僵蠶10 g、川芎5 g，由湖南中醫藥大學湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室按比例加水煎煮濃縮，冷凍備用。用時取24 g/kg，以生理鹽水配成溶液灌胃。17β-雌二醇由湖南中醫藥大學第一附屬醫院采購。灌胃容量均10 ml/kg，每天1次。

1.4 動物分組及給藥

大鼠編號1～40，從隨機數字表第12行第1個數(48)開始，從左向右除以40，余數在1～10者分在假手術組，余數11～20者分在模型組，余數21～30者分在雌激素組，余數31～40者分在加味腦泰方組；分組出現分布不均，以樣本數多的假手術組、模型組樣本數除以隨機數字表中下一個隨機數字，再根據余數調整到雌激素組、加味腦泰方組，最終每組各10只大鼠。

動物適應喂養3 d后，模型組、雌激素組、加味腦泰方組行卵巢摘除術；術后11 d，雌激素組、加味腦泰方組每天分別予雌激素0.18 mg/kg、加味腦泰方24 g/kg灌胃，連續3 d，假手術組、模型組予等量生理鹽水灌胃；術后14 d，模型組、雌激素組、加味腦泰方組制備腦缺血模型。

1.5 造模方法

參照文獻[9]行卵巢摘除術。模型組、雌激素組、加味腦泰方組術前禁食12 h。10%水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射麻醉。無菌條件下背部兩側切口約3 cm，扎緊輸卵管后切除卵巢。縫合切口。術后第5天開始取大鼠陰道分泌物涂片，每天1次，共5 d，以不出現動情周期反應為造模成功。假手術組背部切口后直接縫合。術后予腹腔注射青霉素每天16萬U，共3 d。

采用線栓法[10]制備大鼠腦缺血模型。大鼠卵巢摘除成功，并連續給藥3 d后，禁食12 h，于術后14 d以10%水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射麻醉，頸正中切口，鈍性分離，暴露右頸總動脈，分離頸內動脈、頸外動脈，結扎頸外動脈近心端及遠心端。將魚線插入頸內動脈，深(18.5±0.5)mm，至微感阻力，固定線栓。逐層縫合。腦缺血后24 h采用Longa評分法進行神經功能評分[11]，1～3分為模型成功，0分和4分者剔除。假手術組切開皮膚、分離右頸總動脈后縫合。

1.6 TUNEL染色

神經功能評分后，每組隨機取5只大鼠，10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，消毒后冰盒上分離大腦，取腦組織，多聚甲醛固定，石蠟切片，海馬切片行TUNEL染色。常規脫蠟，PBS洗2次；加20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K消化30 min，PBS洗2次；加過氧化氫封閉內源性過氧化酶活性，PBS洗2次；加TUNEL反應液100 μl，37 ℃孵育60 min，PBS洗3次；加POD 37℃孵育30 min，PBS洗3次；DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片，光鏡下觀察。取5個不重復高倍視野，計數視野中陽性細胞數占總細胞數的百分比，取均值。

1.7 Western blotting

神經功能評分后，另5只大鼠以10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，消毒后冰盒中取出右側海馬組織置于液氮凍存，-80℃冰箱保存。按說明書提取蛋白，考馬斯亮藍法檢測蛋白質含量。經灌膠、上樣、凝膠電泳、轉膜后，加入5%TBST-BSA室溫封閉1 h，分別加ERK1/2、JNK、p-ERK1/2、p-JNK一抗(均1∶100)和β-actin一抗(1∶500)，4 ℃搖床過夜，用TBST室溫下脫色搖床洗2次，每次10 min，再用TBS 洗 10 min。 加 入 ERK1/2、 JNK、 p-ERK1/2、p-JNK二抗(均1∶2500)，室溫孵育1 h，TBST室溫脫色搖床洗2次，每次10 min，再用TBS洗10 min。ECL化學發光法顯影1 min后，凝膠成像系統掃描成像，以β-actin為內參，用Quantity One軟件分析目標條帶的相對光密度。計算p-ERK1/2與ERK1/2、p-JNK與JNK的比值，代表ERK1/2和JNK活化程度。

1.8 統計學分析

所有數據用SPSS 22.0統計軟件進行處理。各組神經細胞凋亡率及p-ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達采用單因素方差分析及LSD檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 細胞凋亡率

假手術組偶見凋亡細胞，模型組可見較多凋亡細胞，核被染成棕黃色，胞體縮小；雌激素組和加味腦泰方組凋亡細胞數下降。見圖1。

與假手術組比較，模型組、雌激素組、加味腦泰方組細胞凋亡率顯著升高(p＜0.001)；與模型組比較，雌激素組、加味腦泰方組細胞凋亡率顯著下降(p＜0.001)；雌激素組和加味腦泰方組海馬細胞凋亡率無顯著性差異(P=0.973)。見表1。

表1 各組細胞凋亡率比較(%)

2.2 p-ERK1/2和p-JNK

與假手術組比較，模型組、雌激素組p-ERK1/2表達顯著降低(p＜0.001)，加味腦泰方組p-ERK1/2表達無顯著性差異(P=0.065)。與模型組比較，雌激素組(p＜0.01)、加味腦泰方組(p＜0.001)p-ERK1/2表達明顯升高。與雌激素組比較，加味腦泰方組p-ERK1/2表達顯著升高(p＜0.001)。見圖2、表2。

與假手術組比較，模型組、雌激素組p-JNK表達明顯升高(p＜0.01)，加味腦泰方組p-JNK表達無顯著性差異(P=0.088)。與模型組比較，雌激素組、加味腦泰方組p-JNK表達顯著降低(p＜0.001)。與雌激素組比較，加味腦泰方組p-JNK表達無顯著性差異(P=0.193)。見圖2、表2。

圖1 各組大鼠神經細胞凋亡(TUNEL染色，400×)

表2 各組海馬ERK1/2、JNK活化程度比較

圖2 各組海馬Western blotting檢測結果

3 討論

凋亡是腦缺血再灌注后神經元死亡的一種重要形式，有研究表明，腦缺血后細胞存活還是凋亡，取決于ERK1/2通路和JNK通路活化的動態平衡[12]。ERK激活保護神經細胞，而JNK激活導致神經細胞凋亡。

ERK1/2可被各種刺激磷酸化激活，p-ERK轉入細胞核，進而介導轉錄因子的轉錄活化(磷酸化)，本身則持續活化，最終促進細胞增殖、凋亡等[13-14]。本研究顯示，卵巢摘除腦缺血大鼠ERK1/2活化降低，與部分文獻報道一致[15-17]，部分文獻不一致[18-20]。這可能與ERK通路激活與預適應、上調抗氧化因子轉錄等保護作用有關[18]。ERK1/2既可促進神經細胞凋亡，也可促進其生長，不同作用取決于激活通路不同[21]。

JNK也可被應激刺激激活，進一步使核內轉錄因子c-Jun氨基末端63及73位絲氨酸殘基磷酸化，進而激活c-Jun，增強其轉錄活性。本研究顯示，卵巢摘除腦缺血大鼠JNK活化升高，與文獻報道一致[22]。

加味腦泰方君藥黃芪含有黃芪甲苷、黃芪多糖等多種成分，其中黃芪甲苷能抑制腦缺血再灌注后神經細胞凋亡[23]，黃芪多糖能緩解腦缺血造成的神經元損傷[24]。川芎嗪是川芎的主要成分之一，具有抗缺血再灌注損傷作用，可能是通過下調JNK信號通路的轉導，減輕大鼠海馬神經元的損傷[25]。本研究顯示，卵巢摘除腦缺血大鼠予加味腦泰方灌胃后，神經細胞凋亡率下降，大鼠海馬ERK1/2活化升高、JNK活化降低，提示加味腦泰方通過促進ERK通路、抑制JNK通路，抑制神經細胞凋亡。

加味腦泰方對ERK與JNK信號轉導通路作用強度還需進一步應用相應的激活劑或抑制劑進行觀察。加味腦泰方調節ERK、JNK通路的具體機制尚需進一步研究。

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