中華絨螯蟹MSTN基因SNPs多態性及與生長性狀的關聯分析

陳義培　吳　廉　陳曉雯　岳武成　黃　姝　王　軍　王成輝

(上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心, 上海水產養殖工程技術研究中心,農業部淡水水產種質資源重點實驗室, 上海 201306)

肌肉生長抑制素(Myostatin, MSTN), 又稱生長分化因子8(Growth differentiation factor-8, GDF-8),是生物體內廣泛表達的一種糖蛋白, 對肌肉生長發育起著負向調控[1]。該基因自從被發現后就引起了研究者的廣泛興趣, 生產出了“雙肌牛”、“超級鼠”[2,3]。在家畜的研究中發現, MSTN基因多態性與豬的生長和肉質性狀等存在關聯[4—6]; 該基因的多態性與南陽牛的體高、胸圍等性狀也存在顯著相關性[7]。隨后該基因在水產動物的研究也越來越多, 包括生產出身體增大的模式魚類斑馬魚[8]和青鳉[9], 以及非模式魚類的標記與性狀關聯分析等[10]。在水生甲殼動物, MSTN基因的研究主要集中在基因的克隆與表達方面[11—14], 而與生長性狀的關聯性研究很少, 如Zhou等[15]報道了墨吉明對蝦MSTN基因的SNP與體長、體質量的顯著相關性。當前,MSTN基因已應用于育種領域, 培育出了軀體增大,肌肉量增加的陸生和水生動物[16—18]。深入研究水生甲殼動物中MSTN基因的結構特性對豐富甲殼動物產業育種手段具有指導意義。

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)作為一種具有較高經濟價值的水生甲殼動物, 在整個生長過程中需要經歷18—21次蛻殼。中華絨螯蟹在蛻殼后首先是吸收水分, 然后逐漸被肌肉組織所代替[19]。當肌肉生長發育至一定程度時, 進行下一次蛻殼。我們推測, 肌肉的生長發育對于刺激中華絨螯蟹的蛻殼可能發揮了較為重要的作用。因而, 開展中華絨螯蟹MSTN基因的研究, 不僅對甲殼動物的蛻殼生長研究有較好的科學價值, 而且對于甲殼動物育種(如分子育種)也有較好的指導意義。

單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphisms, SNP)是基因組上單個核苷酸產生的堿基變異, 其具有分布數量多、多態性豐富等特點, 是繼微衛星分子標記之后又一重要的分子遺傳標記。該標記已廣泛應用于基因定位、遺傳多樣性研究和動植物育種等領域[20—24]。本研究擬對不同來源具有不同遺傳背景的中華絨螯蟹MSTN基因的SNP進行分型, 探討不同基因型與生長性狀(體重、殼長)的相關性, 以期為我們中華絨螯蟹的良種選育或分子育種提供相關候選標記。

1　材料與方法

1.1　實驗材料

本實驗材料包括3大類樣本, 第一類是本實驗室的中華絨螯蟹育種群體(剛完成生殖蛻殼的A、B選育系及其正反雜交子一代, 體重規格86.2—194.9 g, 數量120只), 簡稱育種群體; 第二類是選自2010、2012、2014三個年度的全國河蟹大賽參賽樣本, 體重規格207.0—611.3 g, 數量124只, 簡稱大賽群體; 第三類是來自長江、黃河等水系的野生群體, 體重規格49.0—260.5 g, 數量77只, 簡稱野生群體。每個樣本用SCOUT SE型電子天平(精確0.1 g)稱量表面凈水的蟹體重, 用游標卡尺(精確0.01 mm)測量每只樣本的殼長。性狀測量后, 剪取第二步足長節的肌肉用無水乙醇浸泡, 常溫保存, 用于提取DNA。

1.2　基因組DNA的提取及檢測

采用飽和氯化鈉法提取肌肉中的DNA[25]。提取的DNA利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測, 并用核酸蛋白儀檢測儀(Bio-Rad Smartspic plus)測定DNA純度, -20℃保存備用。

1.3　MSTN基因的PCR擴增

根據中華絨螯蟹MSTN基因序列[26](GenBank：EU650662.1), 采用Primer Premier 5.0[27]軟件進行引物設計(F： 5′-GCACGGATGTCCTCTACTT-3′, R：5′-GGGTCTGGCTACCTTGAA-3′), 然后交上海生工生物工程技術有限公司合成。PCR反應總體積為50 μL： 包括25 μL 2×Taq PCR MasterMix (天根生化科技有限公司), 正反引物(0.2 μmol/L)各2.5 μL,DNA模板2 μL, ddH2O 18 μL。反應程序： 94℃預變性3min、94℃變性30s、56.5℃退火30s、72℃延伸60s, 35個循環, 最后72℃再延伸5min, 4℃保存。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 檢測有單一條帶的PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。測序結果經軟件BioEdit進行比對后發現, 該引物擴增產物獲得3個SNP位點, 應用此引物對所有樣本進行PCR擴增并進行測序。

1.4　數據統計分析

首先采用Popgene 32(version 3.2)[28]軟件計算各類樣本的有效等位基因數(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態信息含量(PIC)等遺傳參數, 了解SNP位點在群體中的分布特性。然后應用SPSS20.0[29]軟件的一般線性模型(General linear model, GLM)進行SNP位點與生長性狀(體重、殼長)的關聯性分析, 所構建的線性模型如下：

式中, Yij為個體生長性狀表型值; μ為群體均值; Si為SNP標記的基因型效應, eij為隨機殘差。

2　結果

2.1　MSTN基因SNP位點分型

應用該引物對321個中華絨螯蟹的MSTN基因進行擴增、測序, 經BioEdit編輯后與NCBI斑馬魚該基因序列比對發現, 擴增到的序列為斑馬魚第3外顯子區域。進一步分析序列的核苷酸變異后發現3個SNP (起始密碼子為起點, C714T、G729A、G753T)突變位點, 均為同義突變, 分別命名為S1、S2、S3。通過讀取突變位點的測序峰值進行等位基因的純雜合分型, TC基因型峰值圖為T/C套峰,GA基因型峰值圖為G/A套峰, GT基因型峰值圖為G/T套峰; 峰值圖為單峰的均為對應基因型的純合子。

2.2　MSTN基因SNP位點的多態性分析

本研究3個位點的觀測雜合度與期望雜合度基本相等, 經χ2檢驗, 均處于Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05), 具體遺傳變異情況如表1所示。根據中度多態性原則(0.25＜PIC＜0.50), 3個群體中3個SNP位點表現為中、高度多態性(PIC＞0.25)。

從3個SNP位點在3個群體中的基因型頻率和基因頻率(表2)看, TT基因型在3個群體的S1位點中均占據優勢地位, 等位基因T是為優勢基因; 同樣,AA為S2位點的優勢基因型且等位基因A的頻率高于G, TT為S3位點的優勢基因型且等位基因T占優勢地位。由此我們推測S1、S2、S3三個突變位點的優勢基因型和優勢基因分別為TT、AA、TT和T、A、T。

2.3　MSTN基因SNP位點與生長性狀的關聯分析

對3個SNP位點共9種基因型分別與中華絨螯蟹的生長性狀(體重、殼長)進行關聯分析發現(表3), S1位點的生長性狀在3個群體和總群體中均存在一致性的顯著差異(P＜0.05), 即TT基因型的體重、殼長顯著大于TC、CC基因型, 而S2、S3這兩個SNP位點均沒有表現出這種規律性。將3個位點的優勢基因型S1(TT1)、S2(AA2)、S3(TT3)分別兩兩組合后發現(表4), AA2×TT3組合的生長效果最差, 顯著低于其他基因型組合TT1×AA2和TT1×TT3(P＜0.05)。3種基因型組合TT1×AA2×TT3的平均生長規格雖最大, 但與基因型組合TT1×AA2和TT1×TT3沒有顯著的生長差異(P＞0.05)。

表1　中華絨螯蟹三群體MSTN基因3個SNP位點的遺傳參數統計Tab. 1　Genetic parameters of three SNP sites in the MSTN gene from three populations of Chinese mitten crab

表2　中華絨螯蟹三個群體MSTN基因SNP位點的等位基因及基因型頻率Tab. 2　Genotype and allele frequency of three SNP sites in the MSTN gene from the three populations of Chinese mitten crab

表3　中華絨螯蟹三群體MSTN基因的SNP位點基因型與生長性狀的關聯分析Tab. 3　The association of SNP polymorphisms in MSTN gene with growth traits from three populations of Chinese mitten crab

表4　中華絨螯蟹三群體MSTN基因不同SNP位點組合的生長性狀比較Tab. 4　The growth traits of different SNP genotype combinations in MSTN gene from the three populations of Chinese mitten crab

3　討論

MSTN基因作為肌肉生長發育的直接調控基因, 其SNP特性自發現以來, 在陸生肉用動物中的研究越來越豐富。如不同研究者在多種陸生動物(豬、牛、雞等)[30—36]中均發現了該基因的SNP特性, 并通過大量數據闡明了該基因作為肉用動物分子輔助標記育種方式的可行性。近年來該基因在水生動物中的研究也越來越普遍, 在魚類(草魚Ctenopharyngodon idellu、大黃魚Pseudosciaena crocea、大口黑鱸Micropterus salmoides、尼羅羅非魚Oreochromis niloticus)[37—39]以及軟體動物和貝類(海參Apostichopus japonicus、海灣扇貝Argopecten irradians、蟶子Sinonovacula constricta)[40—41,43,47]中的研究也越來越多。本實驗通過直接測序對中華絨螯蟹的MSTN基因的SNP位點進行分型, 發現了第一外顯子上3個位點的堿基突變(C714T、G729A、G753T), 但均屬于同義突變。這些位點的SNP特性和上述水產動物有所不同, 大黃魚中是第一外顯子發生多處非同義突變, 大口黑鱸的突變位于啟動子區域, 而海參的突變位點又在MSTN的5′非編碼區和編碼區均有分布[37—39]。雖然不同水生動物的MSTN基因的SNP特性具有差異, 但其都和生長性狀具有相關性, 這說明MSTN在陸生動物和水生動物的分子輔助標記育種中具有普遍性。

目前MSTN在水生甲殼動物(蝦、蟹)中的研究也逐漸深入, Zhou等[15]對墨吉明對蝦的MSTN基因進行了研究, 發現3個同義突變和8個非同義突變,并分析得出其和生長性狀的顯著相關性。Covi等[44]在黑背陸地蟹的大螯肌肉組織中發現, MSTN的高表達和骨骼肌中的蛋白合成量具有顯著負相關性。以上研究說明該基因在蝦蟹中具有和哺乳動物相同或者相似的功能, 對肌肉的生長發育具有負調控作用。然而也有部分學者通過基因功能研究等手段發現該基因和陸生動物以及其他水生動物的不同特性, 如De Santis等[45]以及Lee等[46]分別對斑節對蝦和凡納濱對蝦的MSTN進行了研究, 發現敲降該基因會顯著降低實驗組的生長速率, 認為MSTN在對蝦的生長發育過程中可能為有別于其他動物的正調控因子。雖然不同學者對蝦蟹類MSTN基因的研究結果不盡相同, 但是作為水生甲殼動物的代表性動物(蝦蟹)其生長特性本身就和其他動物有所差異。甲殼類的生長發育和蛻殼活動是相互耦合的[44], 蝦蟹類MSTN的功能可能和蛻殼活動相互聯系, MSTN可能受到蛻皮激素的轉錄調控[48]。因此, 在甲殼動物中, MSTN基因的多態性作為生長性狀的分子標記輔助選育是可行的, 但是該基因在甲殼動物中對肌肉發育的具體調控功能還需要結合甲殼動物的生長發育特點進一步深入研究。

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