草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1倍性分析和性腺發育特點

喬　慶　劉巧林,　肖調義,　趙　鑫　鄧亞林　王榮華　黎玉元　何美鳳

(1. 湖南省特色水產資源利用工程技術研究中心, 湖南農業大學, 長沙 410128;2. 水產高效健康生產湖南省協同創新中心, 常德 415000)

草魚(Ctenopharyngodon idella), 屬鯉形目、鯉科、雅羅魚亞科、草魚屬, 是我國淡水養殖中重要的養殖魚類之一, 年產量居四大家魚之首。由呼腸孤病毒引起的草魚出血病, 是造成草魚養殖過程中危害最大的一種, 其超高的死亡率[1], 嚴重制約著草魚養殖業的發展。赤眼鱒(Squaliobarbus curriculus),俗稱野草魚, 屬雅羅魚亞科、赤眼鱒屬。為了改良草魚的抗GCRV能力, 本團隊自2010年起開展了草魚與赤眼鱒的屬間雜交試驗, 成功獲得了1—5齡草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1(以下簡稱雜交F1), 有試驗證明赤眼鱒抗草魚呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV)感染能力優于草魚[2]。目前, 有關雜交F1的研究主要集中在生物學特性[3—5]、形態[6]、生長[7]、營養[8,9]、肉質[10]及其與親本的抗病能力的比較研究[11,12]等方面。現有研究表明, 雜交F1在肉質、抗病能力等方面具有一定的雜種優勢。

雜交育種是水產動物育種的重要方法之一, 雜種后代的遺傳特性和生育性能直接影響雜交方式的選擇。染色體是生物遺傳物質的主要載體, 了解魚類染色體核型對研究物種的進化、遺傳組成及變異等具有重要意義, 可為物種鑒定、雜交育種、性別決定等方面提供科學依據[13]。同一群體的DNA含量是恒定不變的, 具有物種特異性, 利用流式細胞儀測定細胞核DNA含量, 可快速且有效地鑒別物種倍型, 為生物的種質鑒定和分子遺傳學提供科學依據[14]。有關草魚與赤眼鱒雜交后代的研究指出草魚(♀)與赤眼鱒(♂)雜交得到的F1具有較強的抗逆[4]; 赤眼鱒(♀)與草魚(♂)雜交得到的F1體細胞染色體為2n=48, 從細胞遺傳學角度證明赤眼鱒(♀)與草魚(♂)雜交F1為二倍體[15]; 黎玉元[16]對草魚(♀)與赤眼鱒(♂)雜交F1及其父母本染色體核型進行了比較。目前, 關于草魚(♀)與赤眼鱒(♂)雜交F1染色體數目、DNA含量等的相關研究較少。魚類遠緣雜交子代的生育性能與其性腺發育情況密切相關, 研究性腺結構有利于了解個體的生理發育狀況,可從表觀上判別雜交子代的繁育能力, 為物種的繁衍、保護、利用和開發提供基礎資料。在遠緣雜交中, 多數雜交后代的生育性能較為復雜, 研究者根據性腺顯微結構將其分為不同發育類型： 如精巢型、卵巢型、脂肪型、兩性嵌合個體、卵巢發育不正常個體、卵巢發育正常個體、精巢發育異常個體和精巢發育正常個體等[17—19], 遠緣雜交得到的大部分雜交后代是不育的, 但也不是絕對不育[20]。本試驗擬通過研究雜交F1的染色體數量和核型, 檢測雜交F1細胞核DNA含量, 并對其性腺進行觀察,以期從細胞水平、分子水平和個體水平闡明其遺傳特性和性腺發育情況, 探討遠緣雜交后代的生育能力, 為雜交F1的后期選育和遠緣雜交工作提供基礎資料。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

實驗魚來自湖南省瀏陽市烏龍漁場和湖南農業大學水產養殖基地, 健康狀況良好, 雜交F1、草魚和赤眼鱒各10尾用于染色體制備; 雜交F1為15尾、草魚5尾和赤眼鱒5尾用于DNA含量測定; 雜交F1共124尾(1—5齡), 草魚5尾(3—5齡), 赤眼鱒11尾(1—5齡)用于解剖和切片觀察。所取樣本體重20—3420 g, 用于染色體制備和DNA含量測定的實驗魚運回實驗室后在循環水養殖系統中暫養, 解剖和切片觀察所用魚現場觀察和取樣。

1.2　染色體的制備

參照舒琥等[21]的染色體制備方法, 每尾魚以10 μg/g (魚體質量)胸腔注射植物血球凝集素(PHA),12h后以15 μg/g再次注射, 3h后再以6 μg/g注射PHA, 此時在胸腔另一側以4 μg/g (魚體質量)注射秋水仙素, 1h后解剖魚體取腎組織, 制備細胞懸液,0.075 mol/L KCl低滲處理40min, 卡諾固定液固定3次, 每次30min, 采用空氣干燥制片法制作染色體標本。在顯微鏡下各選取100個分散良好的分裂相,統計各細胞中的染色體數目, 確定染色體總數, 同時選取10個分散良好、長度適中(正中期)、著絲點清晰、染色體數目與上述統計眾數相一致的中期分裂相, 用Adobe Photoshop 6.0進行放大, 測量染色體長短臂數值, 按照Levan等[22]提出的標準對染色體進行配對和排列, 完成草魚、赤眼鱒及雜交F1核型圖。

1.3　DNA含量測定

在魚體尾靜脈處用含抗凝劑的注射器采血0.2 mL, 用德國Partec Gmbh提供的500 μL DAPI染液(用于細胞核著色)中加入500 μL血液和抗凝劑的混合物, 避光反應5—10min, 經20 μm尼龍濾器(德國Partec GmbH提供)過濾, 用德國生產的Partec流式細胞儀進行樣品檢測。雞(Gallus domesticus)血采自翅膀靜脈, 處理方法同上。

以雞的紅細胞DNA含量(2.50 pg)作對照標準。DNA絕對含量計算公式如下： P1=P2×E2/E1。式中： P1表示檢測魚DNA絕對含量(pg), P2表示標準雞DNA絕對含量(2.50 pg/N), E1表示雞紅細胞熒光值, E2表示檢測魚紅細胞熒光值。按照耿波等[23]提出的用DNA指數(DI)判別物種倍性的方法, 以已知草魚為參照, 對雜交F1倍性進行判定。

1.4　性腺組織觀察

解剖前對每尾魚進行拍照編號, 測量魚體體長、全長和體重, 取鱗片; 解剖后稱取完整性腺重和去內臟重, 觀察并記錄發育特征, 計算性腺成熟指數。剪取新鮮性腺中部組織, 置于含AFA固定液的10 mL離心管中固定24h, 期間更換一次固定液。配制所需各種試劑, 溶蠟(反復融化3次); 用微流水沖洗固定好以后的樣品過夜, 第二天取出沖洗后的性腺組織塊進行修整, 使大小均勻、橫切面平整,再進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片與粘片、脫蠟、染色、脫水、透明等處理, 封片后在顯微鏡下進行觀察。

2　結果

2.1　染色體核型

經統計, 雜交F1及其親本的染色體眾數均為48條, 其中雜交F1染色體數為48條的細胞出現頻率為73%, 親本草魚及赤眼鱒分別為62%和71%(圖 1)。

根據Levan等[22]標準對雜交F1及其母本草魚和父本赤眼鱒的染色體進行分類, 得到各自的染色體核型公式(表 1、圖 2)。結果表明, 雜交F1染色體數目與親本保持一致, 染色體類型由中部著絲點(m)、近中部著絲點(sm)以及近端部著絲點(m)三種類型構成, 無端部著絲點(t)、異型性染色體、次縊痕及隨體等結構, 1—2對染色體類型的配比與親本有差異, 臂數相對一致。

2.2　草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1的DNA含量測定

以DAPI作熒光染料, 應用流式細胞儀分析草魚、赤眼鱒和雜交F1血細胞DNA結果。草魚熒光強度為(50.40±7.31), 赤眼鱒熒光強度為(43.50±6.50), 雜交F1熒光強度為(46.2±10.81)。以雞血細胞DNA絕對含量2.30 pg作標準, 計算出草魚絕對DNA含量為(3.50±0.66), 赤眼鱒絕對DNA含量為(3.02±0.48), 雜交F1絕對DNA含量為(3.21±0.61)(表 2)。

5尾草魚DNA： 15尾雜交F1DNA約為1∶0.92,5尾赤眼鱒DNA： 15尾雜交F1DNA約為1∶1.06。DNA指數[23](DI)指出, 當一組細胞DNA平均含量與正常細胞相比較的數值介于1±0.1時, 該細胞為正常二倍體細胞。因此, 以已知二倍體草魚和赤眼鱒與雜交F1對比分析, 可以判別出雜交F1為二倍體。

2.3　性腺觀察

圖 1　雜交F1及其親本染色體數目Fig. 1　Number of chromosomes of the hybrid F1 and its parents

表 1　雜交F1及其親本染色體核型結果Tab. 1　Karyotype of chromosomes for the hybrid F1 and its parents

從2015年12月到2016年6月, 隨機采取124尾雜交F1, 繁殖季節采樣84尾, 非繁殖季節采樣40尾, 經性腺解剖觀察和組織切片鑒定, 樣本中雌性18尾,雄性56尾, 雌雄比約為1∶3, 另50尾個體無法確認性別; 通過觀察鱗片鑒定出可判斷性別的個體的年齡, 并統計樣本數目(表 3)。其中, 2齡和5齡雜交F1的雌雄比為1∶3, 3齡和4齡雜交F1的雌雄比約為1∶3(1齡肉眼及切片無法分辨雌雄)。

卵巢解剖觀察肉眼觀察3齡以上雜交F1多數卵巢兩側大小均一, 淺粉色、扁帶狀, 卵粒較為飽滿, 繁殖季節擠壓腹部有卵粒流出; 少數卵巢發育不良, 兩側不對稱, 卵粒稀少, 形態極為扁平, 組織周圍附著大量脂肪。同期同齡赤眼鱒卵巢發育均勻, 呈粉紅色, 卵粒充實, 輕輕擠壓便有卵粒產出。繁殖季節15尾雌性雜交F1性腺指數(GSI)均值為(1.57±0.01), 同時期雌性赤眼鱒性腺指數均值為(18.33±3.62)。

圖 2　雜交F1及其親本染色體核型圖Fig. 2　The karyotype of the hybrid F1 and its parents

表 2　流式細胞儀檢測草魚、赤眼鱒及其雜交F1 DNA含量Tab. 2　DNA content of the hybrid F1 and its parents by flow cytometry

表 3　雜交F1、草魚和赤眼鱒各年齡階段及其相應樣本數Tab. 3　Number of samples of the hybrid F1 and its parents

組織切片光鏡下觀察, 繁殖季節3—5齡雜交F1卵巢分為兩種類型： 正常發育型, 可看到Ⅰ—Ⅴ時相卵母細胞(圖版Ⅰ-1); 異常發育型, 細胞階段發育均正常, 到第Ⅴ時相, 卵黃顆粒減少, 油滴增加(圖版Ⅰ-2、3), 出現無卵黃空洞狀卵細胞(圖版Ⅰ-4)。雜交F1中, 同時期同個體有正常成熟卵細胞和異常成熟卵細胞(圖版Ⅰ-4); 同時期與同齡赤眼鱒卵巢相比, 部分雜交F1卵巢與之同步(圖版Ⅰ-1、5), 部分發育緩慢(圖版Ⅰ-6、7)。

經解剖觀察和切片鑒定雜交F1卵巢, 繁殖季節中將其分為兩種類型： 正常發育型和異常發育型,其中10尾正常發育, 5尾異常發育, 分別占繁殖季節雌性個體的66.67%和33.33%, 比例為2∶1。非繁殖季節雌性個體無法判斷發育是否正常, 從切片效果看, 2齡開始出現第Ⅲ時相卵母細胞, 此階段2—4齡卵細胞中只有卵原細胞、第Ⅰ時相卵母細胞、第Ⅱ時相卵母細胞和第Ⅲ時相卵母細胞三種類型(圖版Ⅰ-8—10)。

精巢解剖觀察解剖3—5齡雄性雜交F1, 兩側精巢粗細不均勻, 呈不對稱斷帶狀, 粉紅色或暗紅色, 繁殖期擠壓雄魚腹部, 始終無個體有精液流出。同期同齡草魚和赤眼鱒精巢對稱發育, 乳白色,輕輕擠壓有大量精液流出。繁殖季節36尾雄性雜交F1性腺指數(GSI)均值為0.87±0.003, 同時期雄性赤眼鱒性腺指數均值為1.76±0.39。

切片組織光鏡下, 1—5齡雜交F1精巢中有許多精小葉, 精小葉中的精小囊內有初級精母細胞、次級精母細胞和精子細胞, 無成熟精子(圖版Ⅱ-1—5)。同期與同齡草魚和赤眼鱒精巢結構相比,精細胞類型基本一致, 在親本中同樣未觀察到成熟精子。相同倍數下, 雜交F1精巢中的精小囊個數較親本多, 精子細胞數目遠遠少于親本, 部分個體多為結締組織, 精細胞量極少(圖版Ⅲ-6—11)。

性別待定部分雜交F1性腺不明顯, 被脂肪組織覆蓋, 外部形態無法判斷性別, 固定樣品多為脂肪部分, 在光鏡下幾乎觀察不到性腺, 多為脂肪組織和血管(圖版Ⅳ-1-4), 無法判斷雌雄。

3　討論

3.1　草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1的倍性分析

染色體是生物遺傳物質的主要載體, 染色體的數目、形態及結構特征代表一個物種的種屬特性,具有穩定性, 鑒定物種倍性最直觀準確的方法是染色體核型分析。流式細胞儀具有制樣簡單、快速、準確、重復性高等特點, 現已成為分析DNA含量和鑒定倍性的常用方法[24—26]。草魚、赤眼鱒及雜交F1核型和倍性結果同昝瑞光等[27]、舒琥等[28]、金萬昆[15]研究一致, 染色體總數2n=48, 為二倍體個體, 核型和臂數略有差異, 可能是由藥物濃度、處理時間或地理因素引起核型略有差異[29]。魚類遠緣雜交后代的存活主要取決于親本間的相容性, 一般屬種間雜交的相容性較強, 如紅鯽(Carassius auratus red variety, ♀)×湘江野鯉(Cyprinus carpio,♂)[30,31]、方正銀鯽(Carassius auratus, ♀)×興國紅鯉(Cyprinus carpio var. Singuonensis, ♂)[32]、青魚(Mylopharyngodon piceus, ♀)×草魚(grass carp, ♂)[33,34]、團頭魴(Megalobrama amblycephala, ♀)×翹嘴紅鲌(Erythroculter ilishaeformis, ♂)[35]等雜交均獲得了后代。金萬昆[36]指出, 當父母本染色體數量相同或母本染色體數目大于父本時, 兩者間的雜交是相容的, 可得到后代。本研究中草魚染色體數目與赤眼鱒相等, 均為48條, 兩者雜交獲得的后代經染色體核型分析鑒定出其染色體數目與親本相同, 推測可能因草魚與赤眼鱒為同一亞科, 染色體間的相容性較高, 在減數分裂時正常形成配子, 正常受精, 從而使后代染色體數與親本保持一致。遠緣雜交通常形成多種倍性后代, 如草魚與三角魴(Magalobrame Tarminalis)[37]、草魚與鳙魚(Aristichthys nobilis)[38]雜交產生三倍體子代, 鯉(Cyprinus carpio)和鯽(Carasstus anratus)雜交可形成異源四倍體[39]。在本研究中, 經流式細胞術檢測雜交F1細胞核DNA含量證實其為二倍體群體, 暫未發現三倍體個體, 說明雙親染色體在減數分裂過程中染色體行為可能為均等分配、均等結合, 形成二倍體子代。

3.2　草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1的育性分析

肉眼觀察, 與同齡赤眼鱒相比雜交F1的1、2齡個體性腺基本未發育, 絕大多數呈細線狀或被脂肪覆蓋, 難以辨認, 該現象與1、2齡黃金鱸(Perca flarescens)與伊犁鱸(Perca achrenki)雜交后代[40]的性腺發育狀況相似; 3—5齡多數兩側不對稱, 雌雄性腺指數顯著低于同期赤眼鱒。切片發現, 雜交F1卵巢和精巢的前期發育程序基本正常。雜交F1卵巢結構與贛昌鯽(Carassius cuvieri, ♀ × Cyprinus carpio var. singuonensis, ♂)[18]既有相似又有不同, 相似之處表現為少數卵細胞發生卵黃消解, 不能正常發育成成熟卵子, 不同之處在于部分雜交F1的3—5齡卵巢可產生成熟卵細胞并繁殖后代。精巢內精原細胞均可發育至精子細胞時期, 但無任何精子細胞完成變態發育成為精子, 與三倍體湘云鯽(Carassius auratus Triploid)[41]精巢結構有相同點。生產中3—5齡雜交F1中三分之二的雌性可正常排卵受精產生子代, 性成熟年齡與草魚一致; 繁殖期擠壓高齡(3—5齡)雄性F1, 未發現排精個體, 這與興淮鯽[19]的性腺發育情況較為相似, 可能存在敗育現象。擠壓同齡草魚(♂)和赤眼鱒(♂)腹部, 不論個體大小均有卵子和精液排出。草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1性腺結構分析和實踐研究證明, 部分雌性雜交F13齡開始性成熟, 具有可育性; 雄性直至5齡仍未發現排精現象, 也未發現精細胞異常, 只是暫無精子形成,其生育性能有待進一步考究。

3.3　染色體核型與生育性能的相關性

染色體數目和核型不同的親本雜交時會引起彼此間某些等位基因組合發生紊亂[18], 染色體數目相同而核型不同的親本雜交時同樣會引起間個別等位基因組合發生紊亂, 致使胚胎發育受阻, 影響生物個體育性[42]。草魚與赤眼鱒為屬間雜交, 獲得的雜交后代證實兩親本的染色體間存在較強相容性。在可辨別性別的雜交F1群體中, 雜交F1群體中雌雄比為1∶3, 與親本自然群體比例有差異, 導致性別分化的具體原因有待進一步探究。遠緣雜交子代的性腺發育情況較為復雜, 本研究從個體和組織水平, 初步確定雜交F1雌性中存在正常個體和異常個體, 推測可能是親本間的某個等位基因存在某種抑制或干擾, 導致在不同子代個體中基因的表達有差異。從目前來看, 草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1的性腺發育具有復雜性, 今后可從性別相關基因的表達、激素含量的高低以及利用SSR標記等方面對其展開進一步的深入研究。

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圖版 ⅠPlate Ⅰ

圖版 ⅡPlate Ⅱ

圖版 ⅣPlate Ⅳ