外源激素、溫度和親本規格對大刺鰍人工催產及孵化的影響

薛凌展

(福建省淡水水產研究所, 福州 350002)

大刺鰍(Mastacembelus armatus)隸屬鱸形目刺鰍亞目刺鰍科刺鰍屬, 國內主要分布在長江流域以及福建、廣東、廣西、云南和海南等地區。成年個體全長15.5—41.0 cm, 最大體重可達0.5 kg以上[1]。大刺鰍肉質鮮美, 營養豐富[2], 具有很高市場經濟價值和發展前景。近年來由于過度捕撈和環境惡化,導致野生大刺鰍種群資源銳減, 各地區紛紛將大刺鰍列入野生水生動物重點保護名錄。因此加快大刺鰍人工繁育技術研究, 促進其種質資源保護和利用迫在眉睫。

魚類性腺發育是一個復雜而系統的過程, 人工養殖生態環境單一, 較難實現自然繁殖。需要借助于外源激素及環境因子的誘導和刺激, 才能實現人工繁殖[3]。水溫作為魚類繁育過程中重要的環境因子, 直接影響性腺及胚胎發育情況[4]。水溫過高或過低會降低催產激素藥效, 影響催產效果和胚胎發育, 甚至導致難產死亡[5,6]; 魚類親本規格決定了性腺成熟度和精/卵質量[7], 進而影響催產和胚胎發育。因此, 探索大刺鰍親本最佳繁殖規格、外源激素最優組合和催產孵化最適水溫, 是掌握大刺鰍人工繁育技術的生物學基礎。

大刺鰍現有的研究主要集中在性腺發育觀察及營養成分分析[2,8]、消化系統組織學研究[9]、食性及繁殖生物學[10]、胚胎發育觀察[11]、地理種群差異及資源保護等方面[12,13]。目前針對大刺鰍人工催產和孵化條件的研究只有零星報道[14—16], 尚未形成系統規范的繁育技術, 催產率、受精率和孵化率低等問題制約著該品種的規模化生產。本文分別研究了外源激素、環境溫度和親本規格對大刺鰍人工催產及孵化效果的影響, 旨在優化催產及孵化條件, 為該品種規模化繁育提供依據。

1　材料與方法

1.1　試驗材料來源

試驗所用大刺鰍均來自于汀江流域3齡以上親本, 根據汀江不同河段水溫和大刺鰍性腺發育情況,采取分時分段取樣。即5月取汀江上游長汀縣河段野生親本, 6月份取汀江中游上杭縣河段野生親本,7月份取汀江下游永定縣河段野生親本, 所有野生親本經過1周暫養, 選擇性腺成熟度相近、體質健壯的個體作為試驗用魚。試驗所用的DOM、HCG和LRH-A2三種激素均購自寧波第二激素廠。

1.2　試驗方法

催產前準備催產容器為1.0 m×0.6 m×0.8 m(480 L)玻璃缸, 每個容器中放2節PVC管, 供親本躲藏, 上方蓋上一層遮陽網, 防止親魚跳出。整個催產過程保持環境安靜, 減少親魚應激反應。每組配備微孔增氧盤、加熱棒和制冷機(低溫組使用), 溶氧維持在5—6 mg/L, 水溫控制在試驗所設溫度, 誤差為(±1)℃。

親魚選擇大刺鰍雌性親本選擇標準： 體色呈黃褐色體型粗短, 腹部膨大柔軟, 生殖孔微紅且凸起; 雄性親本選擇標準： 體色呈灰褐色體型修長,腹部較硬, 擠壓腹部生殖孔有乳白色精液流出, 雌雄比按1∶1.2配置, 選擇性腺發育成熟度相近的親本進行試驗。

人工催產外源激素組合及劑量設置見表1, 每種配方設3個平行組, 每組催產10尾以上的雌魚和12尾以上的雄魚。催產時3種激素用0.7%的生理鹽水按比例稀釋, 以1 kg魚體重注射1 mL的劑量進行配置激素母液。催產水溫控制在(25±1)℃, 采用背部肌肉注射法, 分2針注射。第1針注射激素總量的20%, 第2針注射激素總量的80%, 2針間隔24h。

催產溫度試驗共設6個溫度, 分別為22℃、24℃、26℃、28℃、30℃和32℃, 每個溫度設3個平行組, 每組催產10尾雌魚和12尾雄魚。

不同規格大刺鰍人工催產試驗設置見表 2, 將雌性大刺鰍(3齡)分為4種規格, 與之配對的雄性大刺鰍(3齡), 體重約100 g的成熟個體, 催產水溫為(25±1)℃。

人工授精試驗采取干法授精, 當效應期到時, 用紗布將雌魚包住, 生殖孔朝下, 擠壓腹部, 使卵子流入干凈的瓷碗中。采取同樣方法將雄魚的精液擠入卵子上方, 用羽毛輕輕攪動30s, 使精卵充分接觸, 完成授精。精卵比例按30 g卵子采用1.5 mL精液的比例進行授精。授精后將卵子均勻布置在孵化網片上, 放入孵化缸進行試驗觀察。

孵化孵化容器為1.0 m×0.6 m×0.8 m (480 L)玻璃缸, 每個孵化缸配6個孵化網片, 通過支架固定,將其直立于孵化缸中。每個玻璃缸配備微孔增氧盤、加熱棒和制冷機(低溫組使用), 溶氧維持在5—6 mg/L, 水溫控制在(±1)℃誤差范圍內。孵化過程每12h換50%水體, 保持水體清潔, 換水溫差不超過1℃, 孵化水溫與催產水溫保持一致。

計算試驗過程記錄各組催產效應期、催產率、平均產卵量、受精率、孵化率和孵化歷時等數據, 統計大刺鰍胚胎發育生物學零度、有效積溫、發育速率和溫度系數值Q10等數據。具體計算公式(1—9)如下：

表 1　外源激素組合及劑量Tab. 1　Combination and dosage of exogenous hormones[(25±1)℃]

表 2　不同規格親本人工催產試驗Tab. 2　The test of artifical induced spawning in different parental weight [(25±1)℃]

生物學零度[18]：

式(7)中C表示胚胎發育生物學零度(℃); n表示溫度梯度個數; T表示胎發育平均溫度; N表示大刺鰍完成胚胎發育所需要時間; V表示胚胎發育所需要時間倒數(1/N)即發育速率。

Q10為胚胎發育速度的溫度系數值, 其計算公式為：式(8)中Q10表示溫差10℃時魚類胚胎發育速度加快的倍數; Ho和Ha分別表示溫度t0和ta時胚胎發育持續的時間[19]。

所有數據由Excel軟件制成圖或表, 再用SPSS軟件進行ANOVA和LSD分析, 采用字母標記法標注數值間的差異顯著性。

2　結果

試驗從2014年5月到2016年7月累計開展大刺鰍人工繁育試驗25批次, 其中2014年催產8批次,2015年催產7批次, 2016年催產10批次, 3年共計催產大刺鰍親本489組, 具體情況見表 3。

2.1　不同外源激素組合對大刺鰍催產效果的影響

如圖 1—3所示, B組合的催產效果較差, 效應期為68h—81h, 只有3組劑量成功催產, 高劑量和低劑量組的大刺鰍均出現難產, 平均催產率均在40%以下, 顯著低于A組合和C組合(P＜0.05)。最高產卵量出現在B3組, 平均每尾達到(510±71) 粒/尾。B2組的效應期最長, 達到(77.7±2.7)h。A組合中5組劑量均可產卵, 效應期為50—70h, 其中A3平均催產率為(73.33±5.16)%, 平均產卵量為(1129±142) 粒/尾, 二者均顯著高于同一激素組合中的其他劑量組(P＜0.05), 效應期也最短, 僅為(51.7±1.9)h。當HCG劑量高于1500 IU/kg(A3)時, 親本對激素的敏感性顯著下降, 達到2500 IU/kg (A5)時, 親本難產的比例逐漸上升。C組合5個劑量組合中有3組的催產率超過50%, 產卵量超過1000 粒/尾, 效應期為48—70.2h。其中C4催產效果最佳, 催產率為(76.67±5.16)%, 產卵量為(1773±71) 粒/尾, 顯著高于其他14個劑量組(P＜0.05), 且C4的效應期最短,僅為(48.4±0.6)h。

表 3　大刺鰍人工催產情況表Tab. 3　The artificial induced spawning of Mastacembelus armatus

圖 1　不同外源激素組合對大刺鰍催產率的影響Fig. 1　The effect of different combinations of exogenous hormones on induced rate of Mastacembelus armatus

圖 2　不同外源激素組合對大刺鰍產卵量的影響Fig. 2　The effect of different combinations of exogenous hormones on fecundity of Mastacembelue armatus

圖 3　不同外源激素組合對大刺鰍催產效應期的影響Fig. 3　The effect of different combinations of exogenous hormones on ovulation time of Mastacembelus armatus

2.2　不同外源激素組合對大刺鰍受精及孵化結果的影響

如圖 4、圖 5所示, 經不同激素配方催產獲得的卵子質量差異較大, 繼而影響其受精和孵化。B組除了B1和B5未產卵外, 其他3組獲得的卵子質量均較差, 受精率僅為9.0%—34.58%, 孵化率僅為6.78%—31.75%。A組合中5個劑量組之間的受精率和孵化率均差異顯著(P＜0.05), 其中A3受精率最高為(75.27±3.56)%, 孵化率達到(68.70±2.21)%, 顯著高于同組合中的其他4組(P＜0.05)。當HCG劑量高于2000 IU/kg(A4), 受精率和孵化率均顯著下降;C組除C1外, 其他4個劑量組的催產效果比較理想,所產的卵子質量較好, 其中C4的平均受精率達到(80.02±1.42)%, 孵化率達到(77.70±1.91)%, 顯著高于其他組(P＜0.05)

2.3　不同規格大刺鰍的催產及孵化結果

不同規格大刺鰍的催產及孵化結果見表 4, 4種規格大刺鰍親本其產卵量差異顯著(P＜0.05), 親本規格與產卵量之間的線性回歸方程為y=19.96x-461.47 (R2=0.9695), 二者呈正相關, 產卵量隨親本體重增加而升高, W4產卵量最高, 達到(2410±157)粒/尾(P＜0.05); 親本規格與效應期呈負相關, 規格越大, 效應期越長, 其中W4效應期最長, 達到(56.3±2.1)h, 顯著高于其他組(P＜0.05); 催產率、受精率和孵化率三者與親本性腺成熟度密切相關, 親本規格越大, 性腺成熟度越高, 所產的卵子質量越好, 三者與親本規格呈正相關。其中W4組的催產及孵化效果最好, 催產率達到100%, 受精率達到(90.33±1.57)%, 孵化率達到(86.77±1.35)%, 均高于其他組。

圖 4　不同外源激素組合對大刺鰍受精率的影響Fig. 4　The effect of different combinations of exogenous hormones on fertilization rate of Mastacembelus armatus

圖 5　不同外源激素組合對大刺鰍孵化率的影響Fig. 5　The effect of different combinations of exogenous hormones on hatch rate of Mastacembelus armatus

2.4　不同溫度對大刺鰍人工催產及孵化的影響

在不同溫度下大刺鰍的催產及孵化結果見表5, 各組的產卵量、效應期、催產率、受精率和孵化率差異顯著, 其中低溫對大刺鰍催產影響較大,T1親本由于積溫不夠, 性腺無法成熟, 導致全部難產; T3、T4和T5三組的催產及孵化效果較好, 平均催產率高于(73.33±5.16)%, 平均產卵量高于(1549.00±93.00)粒/尾。當水溫高于30℃(T5)時, 激素藥效減弱, 催產受抑制, 難產比例增加; 水溫達到32℃(T6), 其催產率和產卵量下降至(50.00±8.94)%和(746.00±81.00) 粒/尾。水溫與效應期呈正相關,當水溫升高, 性腺成熟度加快, 效應期逐漸縮短, 水溫上升至32℃(T6)時, 其效應期最短(P＜0.05), 僅為(39.43±2.87)h, T2的效應期最長, 為(58.43±1.25)h。低溫T2和高溫T6組的受精率和孵化率均較低, 分別為(50.25±4.49)%、(44.98±4.93)%和(62.49±3.87)%、(57.51±5.28)%, 顯著低于其他3個溫度組(P＜0.05)。T4的催產率、受精率和孵化率均最高, 分別為(86.67±5.16)%、(82.68±1.72)%和(80.26±1.78)%。

溫度對大刺鰍胚胎發育速度影響顯著(表 6),水溫與胚胎發育歷時呈負相關, 水溫越高, 胚胎發育歷時越短, 且各組之間差異顯著(P＜0.05)。當孵化水溫為22℃時, 胚胎發育歷時最長, 達到(140.49±1.74)h, 當水溫上升至32℃時, 胚胎發育歷時最短, 僅為(44.35±0.50)h, 32℃比22℃縮短了68.43%。表 8中“器官分化-出膜”占胚胎發育總歷時的比例最大, 為44.56%—51.09%; 其次是“原腸胚-神經胚”, 該階段占胚胎發育總歷時的18.33%—22.39%; “桑椹胚-囊胚”歷時最短, 僅占胚胎發育總歷時的4.14%—6.23%。當胚胎發育至原腸胚后, 溫度對胚胎發育的影響越來越顯著, 溫度越高胚胎發育速率越快。孵化水溫為32℃時, 胚胎發育速率達到0.023±0.0003, 顯著快于其他組(P＜0.05), 所需的有效積溫最短, 僅為(1419.307±15.916)℃·h, 顯著低于其他溫度組(P＜0.05)。當水溫為22℃時, 胚胎發育速率最慢, 僅為0.007±0.0001,所需的有效積溫也最長, 達到(3090.707±38.223)℃·h, 顯著高于其他溫度組(P＜0.05)。由公式統計分析得出大刺鰍的生物學零度為(16.185±0.173)℃。

胚胎發育速度的溫度系數值Q10如表 7所示, 該系數代表某一溫度范圍內水溫變化對魚類胚胎發育的影響, 即溫差10℃時魚類胚胎發育速度加快的倍數。當溫度系數值Q10值在2附近時, 這一溫度范圍即可確定為魚類胚胎發育的最適溫度[19]。表 7列出22℃—32℃不同溫度帶內的溫度系數Q10值,Q10值的變化范圍為(1.40±0.02)—(22.05±2.28), 說明水溫變化對胚胎發育的影響較大, 其中24—32℃溫度帶內的溫度系數Q10值最接近于2, 為1.95±0.01,表明該溫度帶為適合大刺鰍孵化的水溫范圍。

3　討論

3.1　外源激素對大刺鰍人工催產及孵化的影響

當大刺鰍的性腺發育至Ⅳ期末時, 可接受外源激素作用的時間僅為30d左右, 因此抓住最佳催產時機是提高人工繁育效率的關鍵。目前大刺鰍人工催產所用的激素組合、劑量和方法尚未規范, 催產效果參差不齊[14—16,20]。2014年開始, 我們選擇了HCG、DOM和LRH-A2三種外源激素15種激素組合進行催產試驗, 分析比較了單一激素和混合激素配伍的催產及孵化效果, 結果顯示： 在適宜的劑量范圍內3種激素組合均能使大刺鰍產卵和排精, 其中單獨注射HCG和3種激素混合(HCG+DOM+LRHA2)配方的綜合催產及孵化效果明顯好于2種激素混合(DOM+LRH-A2)的配方, 且含有HCG的激素組合其效應期比不含有HCG的激素組合短, 可見HCG是大刺鰍人工催產不可或缺的激素種類, 這一結果和張建銘等[15]和宓國強等[21]的研究一致。試驗結果顯示3種激素混合使用的結果好于單獨注射HCG, 這是因為3種激素混合使用時, 其藥效的疊加效應[22], HCG在其他2種激素之前先作用于性腺, 使其分泌甾類激素, 產生正反饋作用, 加速LRH-A2與垂體細胞的受體結合, 釋放GtH, 提高激素的效價。此外, 3種激素混合使用時, DOM可大幅增加LRH-A2誘導魚類腦垂體分泌GTH和排卵綜合效果, 縮短效應時間[23]。

表 4　不同規格大刺鰍其催產及孵化結果Tab. 4　The oxytocin and incubation in different parental weight of Mastacembelus armatus

表 5　不同溫度對大刺鰍人工催產及孵化的影響Tab. 5　The effect of temperature on artificial induced spawning and incubation of Mastacembelus armatus

表 6　在不同溫度下大刺鰍胚胎發育時間、發育速率和積溫值的變化情況Tab. 6　The development time, development speed and accumulated temperature of embryonic of Mastacembelus armatus under different temperature

表 7　大刺鰍胚胎在不同溫度帶的Q10值Tab. 7　The Q10 of embryonic of Mastacembelus armatus under different temperature regime

本文3種外源激素組合中劑量的變化直接影響到催產效果, 劑量過低或者過高其催產效果均不佳,且影響到孵化效果。當外源激素注射劑量過低時,魚體血液中的GtH濃度不足, 無法啟動性腺產卵/排精活動或者延長效應時間, 容易出現滯產。當外源激素注射過量時反而降低了GtH細胞分泌作用的敏感性, 往往催產效果不佳。一次注射外源激素也能實現人工催產[15,20], 但是效果不如多次注射, 分次注射可以使魚體內GtH作用于性腺的時間延長, 可以更好地催熟性腺[24]。由于大刺鰍生性膽小, 應激反應大, 多次注射間隔時間太短, 操作頻率太高容易導致親魚造成生殖脅迫[25], 影響了催產效果, 產后恢復慢且死亡率高。因此, 本文采取提高注射劑量同時延長兩針注射間隔(24h)的方法, 將人工操作對親魚造成的生殖脅迫降到最低。

3.2　溫度對大刺鰍人工催產及孵化的影響

溫度是影響魚類生殖至關重要的因素之一[26—28],魚類通過感覺器官感受環境溫度, 將信號傳遞至腦,使下丘腦分泌促性腺激素釋放激素(GnRH), 激發垂體分泌GtH作用于性腺, 促使其分泌性類固醇激素, 誘導性腺發育成熟排卵/精, 這是水溫調控性腺發育成熟的機理[24]。適宜的水溫有助于外源激素啟動腦垂體分泌GtH和性腺分泌類固醇激素, 水溫過高或者過低均會阻礙該機制的啟動, 影響催產效果, 甚至出現難產等現象[23]。魚類胚胎發育主要靠孵化酶的作用才能完成[29,30], 此時水溫的變化將直接影響孵化酶活性, 導致胚胎發育紊亂或者滯育。因此, 探索大刺鰍催產及孵化所需的適宜水溫, 是提高人工繁育效率的關鍵。從本文設置了6個溫度梯度, 綜合分析了催產及孵化過程各項指標的變化情況, 結果顯示： 24—32℃是大刺鰍適宜催產及孵化的水溫范圍, 該溫度范圍內大刺鰍催產的效應期為(39.43±2.87)—(58.43±1.25)h, 與水溫變化呈負相關; 受精卵孵化歷時為(44.35±0.5)—(75.74±0.63),與水溫變化呈負相關, 這與尹家勝等[28]、胡振禧等[31]、董根等[32]和韋正道等[33]研究結果一致, 隨著水溫升高, 效應期和孵化歷時逐漸縮短, 高溫環境導致魚體對外源激素的敏感性下降, 不利于GtH的分泌, 阻礙了性腺成熟, 同時也降低了孵化酶的活性, 影響卵裂和器官形成, 容易導致難產和胚胎畸形或滯育。

3.3　親本規格對大刺鰍人工催產及孵化的影響

在外源激素的誘導下規格小的親本比規格大的親本性腺更早成熟, 催產效應期更短, 大規格親本對外源激素的誘導反應需要更長的時間啟動排卵/精活動。此外, 大刺鰍產卵量與親本的規格呈正相關, 規格越大產卵量越高, 這與劉霆等[8]和黃永春[10]開展的大刺鰍生物學性狀研究結果相一致。規格較小的成年大刺鰍親本一般在繁殖季節的前期即成熟, 而較大規格的親本則需要更長的發育時間, 一般在繁殖季節的中后期成熟。從孵化的相關指標分析, 大刺鰍親本的規格決定了卵子質量, 規格越大, 卵子質量越好, 產卵率、受精率和孵化率均較高。因此在人工繁育過程中, 如果碰到規格差異較大時, 大規格個體應適當提高激素注射劑量,方可確保人工催產同步性。

4　結論

綜上所述, 開展大刺鰍人工催產時應將親本按規格進行分批次催產, 有利于正確掌握人工授精時機, 提高生產效率。親本篩選時應盡量選擇大規格的魚種進行催產, 雌性親本選80 g/尾以上, 雄性親本選100 g/尾以上, 確保精卵質量。大刺鰍人工催產及孵化的適宜溫度為24—32℃, 最佳溫度為28℃。人工催產最佳外源激素組合為HCG+DOM+LRH-A2, 建議使用劑量為1000 IU+5 mg+6 μg。在生產過程中, 應根據大刺鰍親本規格, 性腺成熟度,水溫條件等實際情況調整外源激素劑量, 才能提高大刺鰍的繁育效率。

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