早期新生兒不明原因嚴重高膽紅素血癥基因篩選

魏 萌，李 菁，楊麗菲，胡 瑞

(上海兒童醫學中心新生兒科，上海 200217)

高膽紅素血癥是新生兒最常見的疾病之一。60%～80%的新生兒會發生黃疸或新生兒高膽紅素血癥，至今臨床上仍有約50%黃疸患兒的病因不明確[1]。部分新生兒嚴重時可發展為急性膽紅素腦病(acute bilirubin encephalopathy，ABE)或核黃疸，將顯著增加新生兒死亡率，幸存的新生兒可能會出現長期的神經系統后遺癥，如腦癱、耳聾、智力障礙或嚴重發育遲緩等。現有的臨床指南建議，早期發現新生兒患嚴重高膽紅素血癥的風險，可利于及時、有效地預防相關并發癥的發生。引起新生兒重癥高膽紅素血癥的原因很多，形成因素也較為復雜，往往是多種因素綜合作用的結果。近年我國對新生兒高膽紅素血癥臨床原因的分析較多。2009年北京兒童醫院新生兒中心研究發現，重癥高膽紅素血癥的危險因素中臨床最常見的是感染，其次是原因不明、早產、溶血、窒息、頭顱血腫、遺傳代謝病。臨床上，很多不明原因的黃疸與基因改變有關。目前關于新生兒黃疸基因研究主要集中在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1(uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1 Al，UGTlAl)基因多態性方面。

據此，在不明原因高膽紅素血癥患兒中通過評估家族史、基因監測等發現基因突變人群，對這類患兒進行長期隨訪，同時對這類患兒家屬今后生育子女及早采取預防措施是降低膽紅素腦病發生的有效途徑之一，也可進一步深入研究不明原因嚴重高膽紅素血癥的發生機制。

1對象與方法

1.1研究對象

對上海兒童醫學中心新生兒科2015—2016年收治的嚴重高膽紅素血癥59例患兒進行分析，以探討UGT1A1基因突變與新生兒不明原因嚴重高膽紅素血癥的相關性。根據對光療的反應將59例患兒分為難治性高膽紅素血癥組(難治組)和非難治性高膽紅素血癥組(非難治組，難治性：光療8h后，血清膽紅素下降小于5mg/dL或黃疸退而復現，再次達到光療或者換血標準)。納入標準：原因不明，出生14d之內，重癥高膽紅素血癥血清膽紅素峰值達342mol/L以上，以非結合膽紅素增高為主，非結合膽紅素占總膽紅素的80%以上的足月患兒。患兒入院時家屬即簽署知情同意書。排除標準：生后>14d、新生兒溶血病、新生兒窒息、先天性心臟病和消化道畸形引起攝入不足、感染、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)缺乏、頭皮血腫、出血性疾病、使用影響膽紅素代謝的藥物、胃腸外營養及患兒乙肝表面抗原陽性或其他肝臟疾病；監護人拒絕行基因檢測的；研究者認為有不適合參加試驗的任何其他情況。

1.2研究方法

本研究為非隨機對照試驗。通過監測外周血白細胞基因組DNA UGT1A1測序，了解不明原因高膽紅素血癥患兒UGT1A1突變發生率及類型，比較不明原因的難治性嚴重高膽紅素血癥患兒和非難治性嚴重高膽紅素血癥患兒UGT1A1基因突變的發生率的差異。基因檢測：采外周靜脈血2～4mL，設計UGT1A1基因PCR擴增引物，采用Taq DNA聚合酶試劑盒對DNA樣本UGT1A1基因(外顯子及其側翼序列)擴增，擴增后電泳條帶特異，ABI3100測序儀Sanger測序；試驗中止標準：原因不明嚴重高膽紅素血癥患兒相關實驗檢查回報，找到明確病因者，予以剔除。收集患兒一般資料：性別、胎齡、分娩方式、出生體重、Apgar評分、日齡、喂養方式、生長發育情況等。

1.3統計學方法

應用SPSS 17.0軟件包對數據進行整理分析。計量數據資料用均數±標準差表示，正態分布方差齊性計量資料采用t檢驗；非正態分布或方差不齊計量資料采用Mann-Whitney秩和檢驗。計數資料用例數、百分比描述，分析采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義，見表1。

2結果

2.1一般情況

在59例患兒中，難治組47例，非難治組12例。兩組間一般情況比較未見明顯統計學差異(均P>0.05)，見表1。

表1 基本資料比較Table 1 Comparison of basic

2.2兩組間基因突變類型分析

難治組中檢測到UGT1A1基因純合突變5例，全部均為G71R純合突變；檢測到雜合突變共29例，其中G71R雜合突變26例，突變頻率為65.957%(31/47)，為熱點突變點。26例G71R突變中21例不伴有UGT1A1基因其他位點突變。c.1091C>T,p.P364L雜合突變4例，突變頻率為8.511%(4/47)；檢測到c.529 T>C,p.Cys177Arg 雜合突變1例；檢測到c.1352C>T,p.P451L 雜合突變1例；檢測到c.456T>G,p.Tyr486Asp雜合突變 1例；發現2例c.536T>A,p.Leu179Gl雜合突變，這是既往未報道過的新的UGT1A1突變位點。8例未檢測到基因突變。

非難治組中檢測到UGT1A1基因純合突變2例，全部均為G71R純合突變。檢測到雜合突變共7例，其中G71R雜合突變6例，突變頻率為66.667%(8/12)，為熱點突變點；6例G71R突變中5例不伴有UGT1A1基因其他位點突變。c.1091C>T,p.P364L雜合突變1例，突變頻率為8.333%(1/12)；檢測到c.1352C>T,p.P451L 雜合突變1例；3例未檢測到突變。兩組間基因突變無明顯統計學差異，見表2。

表2 兩組基因突變比較[n(%)]Table 2 Variance analysis of gene mutation between two groups[n(%)]

2.3 UGT1A1不同突變基因組比較

將UGT1A1突變分為無突變、純合突變、雜合突變三組，對比患兒一般情況，發現患兒入院日齡在無突變組與純合突變組之間有差異，F=4.4831，P<0.05；患兒出院黃疸值在純合突變組和雜合突變組之間有差異，F=3.4423，P<0.05，見表3。

表3 不同基因組的患兒一般資料比較Table 3 Comparison of general information among children of different gene

注：*無突變組與純合突變組比較，P<0.05；**純合突變組與雜合突變組比較，P<0.05。

3討論

UGT1A1是膽紅素在肝臟結合的關鍵酶，可使膽紅素與葡萄醛酸結合形成結合膽紅素，UGT1A1缺陷可導致非溶血性高未結合膽紅素血癥。UGT1酶的編碼基因定位于2號染色體長臂37區8帶(2 q 378)，它由4個共同外顯子和1個多變的第一外顯子構成，UGT1A1就是由第一外顯子A1和4個共同外顯子(2～5外顯子)組成的復合體。UGT1A1啟動子是一非編碼區，它存在于上游調節區，有調節基因表達的作用，它包含TATA盒，可精確調節轉錄起始的DNA序列。純合子UGT1A1基因啟動子(TA)7TAA突變可導致酶的活性明顯下降，這種UGT1A1基因啟動序列多態性變化與白種人和亞洲馬來西亞新生兒高膽紅素血癥相關，但日本人和中國臺灣新生兒高膽紅素血癥卻與UGT1A1基因Gly71Ary突變(UGT1A1基因第一外顯子211位核苷酸G被A替代，導致71位氨基酸Gly被Arg取代)相關，表明與新生兒高膽紅素血癥相關的UGT1A1基因突變的位點，不同種族之間存在差異[2]。

3.1兩組間基因突變類型分析

本研究發現難治組與非難治組嚴重高膽紅素血癥新生兒中G71R突變頻率分別為65.957%和66.667%，提示我國嚴重高膽紅素血癥漢族新生兒UGT1A1基因中仍以G71R突變為主。有研究發現，在日本、韓國、中國等亞洲國家黃疸新生兒中的G71R是最常見的UGT1A1突變類型，G71R多態性位點的純合突變和雜合突變可使轉移酶活性下降[3]。這與本研究結果一致。

決定高膽紅素血癥不良預后的是膽紅素腦病[4]。該病不僅可導致中樞神經系統損害，甚至可導致死亡。胎齡>35周新生兒血清總膽紅素(serum total bilirubin,TSB)水平在342～427μmol/L時有核黃疸病例報道，G-6-PD缺乏癥患兒黃疸出現時間早、進展快，膽紅素峰值高，且易并發膽紅素腦病[5]，足月兒TSB水平達427μmol/L時即高度提示可能發生高膽紅素血癥，需行頭顱MRI及腦干聽覺誘發電位等檢查。目前，越來越多的研究開始探究重度及極重度高膽紅素血癥的突變基因類型。

3.2本研究的必要性和局限性

大部分病理性黃疸如能及時去除病因、給予光療或者換血，預后較好。在臨床工作中，經常遇到經過光療后黃疸消退效果不佳及黃疸退而復現的新生兒，對于這一部分難治性嚴重高膽紅素血癥新生兒，一旦形成膽紅素腦病，后果嚴重。故及時尋找病因，積極預防，早期干預及治療尤為重要。本研究對比了難治性嚴重高膽紅素血癥新生兒和非難治性高膽紅素血癥新生兒基因突變類型及發生率，未發現顯著差異。因時間及條件限制，本次研究樣本量仍太小，故兩組間是否存在差異，仍需進一步研究。雖然本研究對比難治性與非難治性嚴重高膽紅素血癥新生兒一般情況及基因突變類型未發現明顯統計學差異，但我國人口眾多、民族豐富，構成了基因多態性的豐富資源。了解種族背景、家族史以及相關的基因學研究，對早期新生兒嚴重高膽紅素血癥的篩查和治療是非常有必要的。

3.3新的突變位點及未來研究方向

在本研究中還發現2例新的UGT1A1基因突變位點，c.536T>A,p.Leu179Gl雜合突變，既往國內外文獻未曾報道此位點基因突變與新生兒高膽紅素血癥的相關性，是否為新生兒高膽紅素血癥致病基因突變還有待進一步研究論證。除此之外，Watchko[6]研究發現G6PD、UGT1A1、OATP2等基因均可能是引起嚴重高膽紅素血癥的危險因素。2009年Boony等認為G6PD突變而非G-6-PD酶活性水平的改變是嚴重高膽紅素血癥的危險因素。Azlin等于2011年研究發現UGT1A1是獨立于G6PD缺乏之外的馬來西亞人群嚴重高膽紅素血癥的危險因素，但其是否增加其他遺傳因素的風險并不明確。盡管本研究納入的病例已排除G-6-PD酶活性異常的新生兒，但尚需對G6PD、OATP2等基因的改變進一步分析研究。這也是未來工作研究的重點。

[1]李軍,李貴南,吳運芹,等.膽紅素-尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶基因突變類型與新生兒高膽紅素血癥的相關性分析[J].中國新生兒科雜志,2016,31(1):28-31.

[2]石航婷,龍雋,鄧俊彪,等.UGT1A1基因多態性分析與新生兒高膽紅素血癥的關系[J].中國新生兒科雜志,2013,28(1):21-24.

[3]Yu Z,Zhu K,Wang L,etal.Association of neonatal hyperbilirubinemia with UGT1A1 gene polymorphisms: a meta-analysis[J].Med Sci Monit,2015,21:3104-3114.

[4]Canu G,Minucci A,Zuppi C,etal.Gilbert and Crigler Najjar syndromes: an update of the UDP-glucuronosyltransferase 1A1 (UGT1A1) gene mutation database[J].Blood Cells Mol Dis,2013,50(4):273-280.

[5]鐘元枝,劉玲,肖體海,等.新生兒G-6-PD缺乏癥合并高膽紅素血癥的臨床分析[J].中國婦幼健康研究,2017,28(1):69-71,80.

[6]Watchko J F.Genetics and pediatric unconjugated hyperbilirubinemia[J].J Pediatr,2013,162(6):1092-1094.

[專業責任編輯：艾 婷]