TAMs在HR-HPV誘發(fā)宮頸癌腫瘤微環(huán)境中的作用

王 珺，陳 星

(浙江省臺州醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 臨海 317000)

宮頸癌是臨床上常見的疾病，屬于我國女性第二惡性腫瘤，僅次于乳腺癌，嚴重影響我國女性健康。現(xiàn)代流行學調(diào)查結果表明：全球每年新發(fā)46.6萬宮頸癌，而約13.15萬在我國，且我國每年有3～5萬人死于宮頸癌[1]。宮頸癌發(fā)病機制復雜，目前普遍認為與高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)感染有關，且90.0%以上宮頸癌患者中能檢測到HR-HPV。此外，HR-HPV病毒感染還容易增加頭頸部癌、肺癌、肛門等腫瘤[2]。國內(nèi)學者研究表明：腫瘤微環(huán)境協(xié)同致癌、腫瘤進展，該過程中會引起機體免疫功能的抑制或失活[3]。腫瘤相關的巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)是宮頸癌患者腫瘤微環(huán)境中含量最多的免疫群體，可能在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。研究表明宮頸癌患者發(fā)病后在多種激活機制作用下可能會對機體免疫反應產(chǎn)生有效的抑制作用，從而能阻止機體對于HR-HPV的清除和宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)的消退，增加疾病的發(fā)生、發(fā)展，腫瘤微環(huán)境中的TAMs促進腫瘤的進展[4]。由此提出假設：HR-HPV相關的宮頸癌腫瘤微環(huán)境中TAMs的活化和功能是以M2功能為主，它們協(xié)同作用可引起HR-HPV持續(xù)感染所致的宮頸癌前病變及隨后發(fā)生的宮頸癌[5]。但是，臨床上對于宮頸癌患者發(fā)生時腫瘤微環(huán)境中的TAMs的狀態(tài)對宮頸癌的發(fā)生發(fā)展的關系尚不完全知曉。因此，本課題以2014年12月至2017年6月宮頸癌患者100例、癌前病變30例及健康體檢者30例作為研究對象，探討TAMs在HR-HPV誘導的宮頸癌腫瘤微環(huán)境中的作用，報道如下。

1資料與方法

1.1臨床資料

選擇浙江省臺州醫(yī)院婦產(chǎn)科2014年12月至2017年6月宮頸癌患者100例，設為宮頸癌組，年齡24～81歲，平均47.94±7.81歲。患者中鱗癌74例，腺癌21例，腺鱗癌5例。分化程度：高分化32例，中分化40例，低分化28例。臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期61例，Ⅲ～Ⅳ期39例。淋巴結：轉移35例，未轉移65例。選擇同期入院治療的宮頸癌前病變患者30例，設為癌前病變組，年齡(26～79)歲，平均(46.15±7.86)歲。CINⅠ級9例，CIN Ⅱ～Ⅲ級21例。選擇同期檢查的健康體檢人群30例，設為健康組，年齡26～82歲，平均(48.58±8.05)歲。本課題均得到醫(yī)院倫理委員會同意，患者及家屬對檢查方案具備知情權。

1.2納入及排除標準

納入標準：①符合《婦產(chǎn)科學》[6]第8版教科書中關于宮頸病變、宮頸癌臨床診斷標準者；②最終均經(jīng)過宮頸活檢或手術檢查最終得到確診；③標本采集前均未進行化療、免疫及放射治療。

排除標準：①經(jīng)手術或組織病理學檢查未能確診者或疑似病灶者；②合并嚴重心、肝、神功能異常或影響腫瘤微環(huán)境者；③難以遵循醫(yī)囑完成相關檢查及治療者。

1.3儀器及設備

DNA合成儀，DNA測序儀，PCR儀，快速電泳儀，高速低溫離心機，離心機，電子顯微鏡，細胞反應器等現(xiàn)代化實驗儀器，見表1。

表1 儀器與設備Table 1 Instruments and equipment

1.4方法

1.4.1病毒蛋白E2、E6、E5、E7和TAMs表達檢測

免疫組化檢測HR-HPV+標本的E2、E5、E6、E7、TAMs的表達：取上述標本，浸泡在10%甲醛溶液中固定，取出固定后的組織石蠟包埋后制備4μm病理切片，1h烘烤，溫度60℃，脫蠟后利用PBS進行2次沖洗，保證整體溶液pH值為7.2～7.4，將標本放置在3%H2O2溶液中20min孵育，消除組織中過氧化物，PBS沖洗3次，每次連續(xù)沖洗3min，向溶液中根據(jù)1:10比例加入山羊血清，孵育15min，去除組織中的血清，滴加抗鼠E2、E5、E6、E7、TAMs單克隆抗體，放置在4℃下24h，常溫下1h，PBS沖洗3次，每次5min，加入生物素標記的E2、E5、E6、E7、TAMs二抗，37℃下孵育30min，利用DAB顯色，蘇木精8～10s復染，中性樹膠封片。在200倍光鏡下每張切片隨機選擇5個視野，觀察切片中陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例，每個視野測定3次后取平均值，倒置顯微鏡下完成不同病理切片組織的顯色反應，E2、E5、E6、E7在切片表明呈觀察不同組織的顯色反應情況。

1.4.2宮頸癌組CD14 、CD163、CD206、CD68表達檢測

采用流式細胞儀測定宮頸癌組織與癌旁組織CD14、CD163、CD206、CD68水平，有關操作嚴格遵循儀器操作說明書完成。主成分分析：檢測不同標本中差異基因表達，轉錄組學進行功能分析，利用R軟件包分析。對獲得的基因完成GO，KEGG，PATHWAY 的分析。根據(jù)表面表達的因子區(qū)分M1/M2基因。取上述標本，提取RNA，定量定性檢測，使用Agilent 公司的microarray 芯片4*44K人類全長基因組芯片，檢測差異基因的表達，轉錄組學分析，主成分分析，熱圖分析，GO，KEGG，PATHWAY 分析等，篩選出M的因子，M1/M2因子：M1為趨化因子(C-C基序)配體5(chemokine C-C motif ligand5，CCL5)、趨化因子(C-C基序)配體9(chemokine C-C motif ligand9，CCL9)、白細胞介素-2RA(interleukin-2RA，IL-2RA)；M2為趨化因子(C-C基序)配體18(chemokine C-C motif ligand18，CCL18)、白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)。

1.4.3 M1/M2因子的表達檢測

采用實時熒光定量(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR法)測定3組M1/M2因子的表達。采用反轉錄試劑盒(ABI公司生產(chǎn)提供)完成miRNA的反轉錄，保證反轉錄整個體系為15μL，通過查閱Sanger micro-RNA序列獲得M1/M2相應的序列引物，根據(jù)每一位標本情況設置反轉錄條件：16℃30min，42℃30min，85℃5min，最后在4℃保持恒溫，將獲得的反轉錄產(chǎn)物采用RT-PCR系統(tǒng)完成定量檢測，保證整個反應體系為20μL，設置PCR檢測反應條件：95℃10min，95min15s，60℃1min，連續(xù)進行40個循環(huán)。最后通過PCR自帶軟件獲得基線與閾值后，設置內(nèi)參，讀取相應M1/M2循環(huán)閾值，計算兩種循環(huán)閾值，采用2-循環(huán)閾值表示M1/M2表達水平。

1.5觀察指標

①E2、E6、E5、E7和TAMs陽性率：觀察3組標本E2、E6、E5、E7和TAMs陽性率情況；②CD14，CD163，CD206，CD68：觀察宮頸癌組患者腫瘤組織與癌旁組織CD14，CD163，CD206，CD68表達水平；③主要分析;觀察3組不同標本主要成分情況；④M1/M2因子的表達。觀察3組標本M1/M2因子的表達情況。

1.6統(tǒng)計學方法

2結果

2.1三組病毒蛋白E2、E6、E5、E7和TAMs陽性率比較

三組病毒蛋白E2、E6、E5、E7和TAMs陽性率均存在顯著性差異(均P<0.05)，宮頸癌組最高，癌前病變組次之，健康組最低，見表2。

表2 三組病毒蛋白E2、E6、E5、E7和TAMs陽性率[n(%)]Table 2 Positive rate of viral proteins E2, E6, E5, E7 and TAMs among three groups[n(%)]

2.2 兩組CD14、CD163、CD206、CD68陽性率比較

宮頸癌組織中CD14、CD163、CD206、CD68陽性率均高于宮頸癌旁組織(均P<0.05)，見表3。

表3 宮頸癌組CD14，CD163，CD206，CD68陽性率比較[n(%)]Table 3 Comparison of positive rates of CD14, CD163, CD206 and CD68 in cervical carcinorna group [n (%)]

2.3三組主成分分析

從主成分分析中，可以看出宮頸癌組的基因表達與健康組和癌前病變組明顯不同，而且各組基因沒有相關性，見圖1。

圖1 三組組織標本主要成分分析Fig. 1 Analysis of principal components of tissue specimens in three groups

2.4三組標本M1/M2因子的表達情況比較

通過SAM 分析(監(jiān)督分析)聚類，調(diào)控基因的表達，共篩選出375個有顯著差異的基因，看不同基因在樣本中差異表達趨勢，有的基因上調(diào)，有的基因下調(diào)，F(xiàn)C是差異倍數(shù)，越接近+5，說明基因上調(diào)，越接近-5，說明基因下調(diào)。宮頸癌組、癌前病變組和健康組不同的基因表達有差異(F=5.361，P<0.05)，見圖2。

圖2三組標本M1/M2因子的表達情況比較
Fig. 2 Comparison of expression of M1/M2 factors of specimens among three groups

3討論

3.1宮頸癌發(fā)生機制

宮頸癌是臨床上常見的疾病，屬于是一種高發(fā)的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多節(jié)段共同參與過程。文獻報道顯示：HR-HPV持續(xù)感染是引起宮頸癌的主要原因，尤其是以HPV16/18為主[7]。當機體感染HPV后宿主細胞將會持續(xù)處于游離狀態(tài)或整合狀態(tài)，而HPV-DNA整合則是HPV致癌的主要原因。多數(shù)HR-HPV DNA能整合到宿主細胞基因組中，引起基因發(fā)生不同程度的缺失、突變，導致機體內(nèi)的促癌基因與抑癌基因平衡受到打破，逐漸演變?yōu)閷m頸癌。

3.2腫瘤相關巨噬細胞在宮頸癌中的作用機制

文獻報道顯示：腫瘤微環(huán)境相對復雜，包括：免疫反應的網(wǎng)絡系統(tǒng)、血管生成因子[8]。而TAMs則是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，在腫瘤的生長、發(fā)展過程中會引起大量的TAMs發(fā)生浸入。從大的角度來說，TAMs主要源于循環(huán)血液中單核細胞分化中。本研究中，三組病毒蛋白E2、E6、E5、E7和TAMs陽性率均存在顯著性差異(均P<0.05)，宮頸癌組最高，癌前病變組次之，健康組最低。TAMs的穩(wěn)態(tài)是由局部組織的單核細胞的增殖所調(diào)控的，彈性與多樣性是巨噬細胞類型的兩大特點，遇到外界刺激的情形下(例如微生物入侵，組織損傷，細胞因子信號以及代謝產(chǎn)物等)，巨噬細胞也分為M1、M2兩種極化類型，分別參與了Th1與Th2的免疫效應過程。本研究中，宮頸癌組宮頸癌組織中CD14、CD163、CD206、CD68陽性率均高于癌旁組織(均P<0.05)。TAMs存在M1/M2二種活性及極化形態(tài)，并與血管新生、腫瘤浸潤及不良預后相關。M1型即經(jīng)典活化性巨噬細胞(Mφ)，M2型替代性活化的Mφ。腫瘤微環(huán)境中，巨噬細胞浸潤腫瘤基底膜破潰處，基底膜破潰是腫瘤細胞侵入周圍基質的必需前提；其次，巨噬細胞釋放細胞因子和趨化因子，促進腫瘤細胞的侵入；TAMs在腫瘤微環(huán)境中被修飾，失去了吞噬腫瘤細胞或者將腫瘤細胞呈遞給T細胞的能力，極化的Mφ進一步影響局部免疫反應，與各種因子協(xié)同作用，調(diào)節(jié)病原體的生物感染結局、腫瘤免疫、參與免疫調(diào)節(jié)和組織的修復。本研究中，通過SAM 分析(監(jiān)督分析)聚類，調(diào)控基因的表達，共篩選出375個有顯著差異的基因，看不同基因在樣本中差異表達趨勢，有的基因上調(diào)，有的基因下調(diào)，F(xiàn)C是差異倍數(shù)，越接近+5，說明基因上調(diào)，越接近-5，說明基因下調(diào)。宮頸癌組、癌前病變組和健康組不同的基因表達有差異(P<0.05)。

綜上所述，腫瘤相關的巨噬細胞在高危型人乳頭瘤病毒誘導的宮頸癌腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮了重要的作用，干擾機體免疫水平，促進疾病的發(fā)生、發(fā)展。

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[專業(yè)責任編輯：張忠明]