植物半胱氨酸可逆氧化修飾蛋白質組學技術研究進展

王 琳, 李 瑩, 戴紹軍, 喻娟娟*

(1.東北林業大學 鹽堿地生物資源環境研究中心東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室,黑龍江,哈爾濱 150040;2.上海師范大學 生命與環境科學學院 植物種質資源開發協同創新中心,上海 200234)

環境脅迫導致植物體內積累過量的活性氧分子(ROS),包括過氧化氫(H2O2)、羥自由基(?OH)、超氧陰離子(O2?-)和單線態氧(1O2)等[1].雖然適量的ROS可以作為信號分子參與脅迫信號轉導,但是過量的ROS會對植物體內的生物分子(蛋白質、DNA、脂質等)和細胞結構造成氧化損傷.蛋白質中的半胱氨酸(Cys)殘基含有富含電子的硫原子,是ROS介導氧化還原的敏感靶點之一[2].Cys可氧化修飾由ROS引發的二硫鍵(S-S)形成、S-谷胱甘肽化(-SSG)、S-磺胺化(-SN)、S-亞磺酰化(-SOH)、次磺酰化(-SO2H),以及S-磺酰化(-SO3H).其中,Cys氧化形成的S-S、-SSG和-SOH可以被相應的還原劑還原成游離巰基(-SH).這三種形式的Cys可逆修飾可以通過調節蛋白質構象影響蛋白質功能.因此,多數研究關注了植物中S-S、-SSG和-SOH等可逆氧化修飾[3].

近年來,逐漸發展起來的一系列氧化還原蛋白質組學技術為系統研究植物氧化還原修飾提供了重要手段[4].其中,差異烷基化技術是研究蛋白質Cys可逆氧化修飾的常用方法.該技術先利用N-乙基馬來酰亞胺(NEM)或碘乙酰胺(IAM)等烷基化試劑封閉游離巰基,再利用還原劑如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫蘇糖醇(DTT)對已被可逆氧化修飾的Cys進行還原,進而應用不同試劑標記還原后新形成的自由巰基,并通過生物質譜鑒定氨基酸序列或Cys位點.因標記試劑不同形成了幾種氧化還原蛋白質組學研究方法.本文作者對這些研究方法進行了綜述.

1 基于熒光標記的雙向電泳(2DE)技術

基于熒光標記的2DE分析技術應用能巰基特異結合的熒光試劑(如單溴二胺mBBr或吲哚乙酰氨基熒光素IAF)標記還原后新形成的自由巰基.其中,mBBr是一種應用最為廣泛的熒光試劑,它能夠穩定結合自由巰基,分子量小,對蛋白質分子量的影響較小,適合被應用于質譜分析.熒光試劑標記后的蛋白質通過2DE被分離,并可以在紫外光下的凝膠上呈現出熒光斑點.蛋白質斑點的熒光強度與mBBr的結合量存在比例關系,據此可以計算出蛋白質中Cys被氧化的程度.進而,通過mBBr信號與蛋白質豐度信號(經Ruby等染色劑獲得)的比值可以判斷蛋白質氧化還原水平的變化[5-7].

2DE是一種經典的蛋白質分離技術,該技術結果呈現方式直觀、成本低廉,但是操作步驟繁瑣,重復性不佳,對于特殊蛋白質(如極端等電點、極端分子量,和低豐度蛋白質)分離效果不好.盡管基于熒光標記的2DE技術可以檢測蛋白質總體Cys氧化還原水平的變化,但無法對蛋白質中被修飾的Cys進行定量分析.

2 基于生物素-巰基特異性試劑標記的技術

2.1 基于生物素-巰基特異性試劑標記的2DE技術

基于生物素-巰基特異性試劑標記的2DE技術應用與生物素結合的巰基特異性試劑,如biotin-HDPD(N-[6-(biotinamido)hexyl]-3′-(2′-pyridyldithio) propionamide)或biotin-IAM/NEM/maleimide,可用于標記還原后新形成的自由巰基,從而使可逆氧化修飾的蛋白質Cys被生物素化.進而,利用可與生物素特異結合的鏈霉親和素(streptavidin)或抗生素蛋白(avidin)柱子富集和純化生物素化蛋白質,并通過2DE分離蛋白質.2DE凝膠上呈現的蛋白質斑點大小反映了Cys被氧化的蛋白質豐度[8].此技術與基于熒光標記的2DE技術類似,無法實現蛋白質中被氧化修飾Cys的定量分析.

2.2 基于生物素-巰基特異性試劑標記的同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)技術

應用生物素-巰基特異性試劑標記的可逆氧化修飾的蛋白質,也可利用iTRAQ技術進行定量分析.iTRAQ技術是美國AB SCIEX公司推出的一項蛋白質組學定量分析技術,其關鍵在于iTRAQ試劑.iTRAQ試劑是一系列小分子同重元素化學物質,由分子量不同的系列報告基團(分子量分別為113,114,115,116,117,118,119,121 u)、中性平衡基團和反應基團三部分組成[9-10].反應基團可以與蛋白質酶切后的多肽的氨基末端或賴氨酸側鏈基團相連,從而實現對蛋白質多肽的標記;質譜檢測到的報告基團的信號強度可以反映每個被標記的蛋白質多肽的豐度.另外,由于生物素-巰基特異性試劑可以與可逆氧化修飾的Cys共價連接,該技術可以對含有可逆氧化修飾的Cys進行定量分析.與2DE技術相比,iTRAQ技術具有更高的靈敏度、檢測通量和重現性,能保證氧化還原多肽鑒定與定量分析的準確性.

3 基于同位素親和標簽(ICAT)標記的技術

基于ICAT標記的技術應用ICAT試劑與還原后新形成的自由巰基反應,可直接實現對蛋白質可逆修飾Cys的定量分析.ICAT試劑由反應基團、連接子和生物素親和標簽三部分組成.反應基團可特異結合肽鏈中Cys的自由巰基,而生物素親和標簽在ICAT標記多肽的分離純化過程中起作用.因連接子中的氫/氘原子存在質量差異,ICAT試劑用“輕標”(連接子含有8個氫原子)和“重標”(連接子含有8個氘原子)加以區分,兩者的質量相差8 u.標記蛋白質酶切后的多肽可經生物素-親和素柱子進行富集和純化,進而通過質譜鑒定分析[11].與iTRAQ試劑相比,ICAT試劑通過特異結合肽鏈中Cys的自由巰基實現定量,因此可直接被用于對氧化還原蛋白質的分析.此外,ICAT試劑自身具有生物素結合位點,可直接利用親和素富集低豐度蛋白,有利于鑒定更多的可逆氧化修飾蛋白質.然而,ICAT試劑只含有兩種標簽,實驗通量相對較低.此外,ICAT試劑分子量相對較大(約500 u),與蛋白質連接后可能會造成分子的空間位阻,在質譜分析時標簽仍保留在肽段上,導致肽段在碰撞誘導解吸附時,容易被片段化,造成質譜圖復雜程度增加,尤其不利于低分子量多肽的分析.

4 基于巰基特異性串聯質量標簽(CysTMT/iodoTMT)標記的技術

基于CysTMT/iodoTMT標記的技術應用CysTMT或iodoTMT試劑與還原后新形成的自由巰基反應,直接實現蛋白質可逆氧化修飾Cys的標記.串聯質量標簽(TMT)技術是由美國Thermo Scientific公司研發的一種多肽體外標記技術.TMT試劑由報告基團、平衡基團和反應基團三部分組成.TMT試劑的反應基團能與肽段氨基末端及賴氨酸側鏈氨基共價連接,從而標記肽段.而在TMT試劑基礎上發展起來的CysTMT和iodoTMT試劑只能與蛋白質中Cys的自由巰基結合,從而只標記含有Cys的多肽.CysTMT和iodoTMT試劑都包括6種質量報告基團,其分子量分別為126,127,128,129,130,131 u.CysTMT試劑的反應基團與Cys自由巰基的結合是可逆的,而iodoTMT試劑的反應基團與Cys自由巰基的結合是不可逆的.因此,與CysTMT試劑相比,iodoTMT試劑標記氧化修飾Cys的效率更高.經CysTMT或iodoTMT試劑標記的蛋白質被酶解為多肽后,標記的多肽可以通過anti-TMT抗體被富集和純化,進而可通過質譜分析被鑒定[12].

CysTMT和iodoTMT試劑都可直接與Cys自由巰基結合,因此可直接用于對氧化還原蛋白質組學的研究.該技術利用anti-TMT抗體實現含有Cys肽段的富集,從而實現了對低豐度氧化還原修飾蛋白的鑒定.然而,盡管這兩種試劑可以直接對蛋白質Cys的氧化還原水平進行定量分析,但是無法同時定量蛋白質豐度,導致無法準確判斷蛋白質氧化還原水平的變化.

5 基于iodoTMT與iTRAQ聯用(iodoTMTRAQ)的標記技術

為了解決同時定量蛋白質豐度與Cys氧化還原水平的問題,美國佛羅里達大學陳思學實驗室發明了iodoTMTRAQ技術.該技術利用iodoTMT試劑標記Cys,同時利用iTRAQ試劑標記多肽氨基末端,實現同時檢測Cys氧化還原水平和蛋白質表達豐度的變化[13-14],這是該技術獨特的優勢.然而,該技術仍然無法克服MS2串聯質量標簽分析帶來的因前體離子干擾造成的標簽豐度比率壓縮問題.

6 結論與展望

近年來不斷發展的氧化還原蛋白質組學技術為研究植物中蛋白質氧化還原穩態提供了更加完善的技術平臺.在2DE凝膠分離技術的基礎上,發展了非凝膠蛋白質分離技術(如納升高效液相色譜與質譜聯用技術),提高了蛋白質分離與鑒定的通量和重現性.同時,對蛋白質Cys的標記技術由最初的熒光試劑標記發展為同位素標簽標記,提高了標記的靈敏度,實現了對Cys的精確定量.尤其是iodoTMTRAQ技術的出現,實現了對蛋白質豐度與Cys氧化還原水平的同時定量分析.這些技術已經被應用于植物發育與響應環境過程中蛋白質氧化還原修飾變化的分析[5-12,14].然而,上述技術雖然能同時標記與定量分析可逆氧化修飾的Cys(S-S、-SSG或-SOH),但是無法區分Cys的具體氧化形式.進一步開發能夠標記和定量分析不同Cys氧化形式的高通量蛋白質組學技術,將有利于深入研究蛋白質氧化還原修飾參與調控的植物發育與環境應答機制.