基于不同傳感器的紐荷爾臍橙葉片葉綠素含量檢測技術評價

李文濤，楊江波，張績，王克健，鄧烈，呂強，何紹蘭，謝讓金，鄭永強，馬巖巖，易時來

（西南大學柑桔研究所/中國農業科學院柑桔研究所，重慶 400712）

0　引言

【研究意義】葉綠素是植物體內與光合作用、碳水化合物合成水平相關的關鍵因素，其含量是表征植物生長的重要指標，且葉片的葉綠素含量與氮含量有顯著的正相關性[1]。及時診斷和了解柑橘植株的葉綠素含量水平，對于果園營養診斷、生產能力評估和施肥決策等具有重要的指導意義。傳統的葉綠素含量測定方法-分光光度法，存在破壞植株組織、分析過程復雜和實時性差等缺點，因此探索建立輕簡、高效多元化的葉綠素含量檢測技術體系具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來，關于作物葉綠素含量的快速檢測研究較多，國內外試驗表明，SPAD可作為葉綠素含量快速檢測的可靠手段，可替代葉片葉綠素含量評價氮素營養狀況，指導生產施肥[2-3]?；诠庾V技術的檢測方法成為農業信息技術的研究熱點，并在小麥、水稻、果樹等方面取得了較好的進展。PINAR 等[4]、GITELSON 等[5]、LAMB 等[6]的研究發現，紅邊位置能較好的反映葉片葉綠素含量；王雪[7]、張浩[8]等通過高光譜和多光譜技術進行小麥、水稻葉綠素含量快速檢測，并獲得相關優化檢測模型。除光譜技術外，一些研究者提出將數字圖像技術應用于植株營養狀況監測，BLACKMER等[9]利用圖像技術建立了玉米作物葉片葉綠素含量預測模型；易時來等[10]采用圖像技術建立了錦橙葉片 SPAD值預測回歸模型。而YADAV[11]和GUPTA等[12]采用掃描儀（HP scan jet 3670）作為信息采集器，以b/L參數值建立土豆葉片葉綠素含量預測回歸模型。法國Force-A公司生產的植物熒光及多酚含量測量儀Multiplex?Research也可代替 SPAD 葉綠素儀，應用于無損、快速評估葉片葉綠素含量及氮素營養狀，Multiplex?Research主要基于多重激發光源（紫外線、藍光、綠光和紅光）瞬間無損測定葉片葉綠素含量、類黃酮含量、花青素含量、紫外線和綠光激發下的氮素平衡指數以及紫外線和紅光激發下的氮素平衡指數等參數[13-14]。【本研究切入點】目前，關于地物光譜儀、數字圖像、熒光及多酚含量測量儀等不同傳感器系統監測與評估柑橘葉綠素等生理指標的研究應用未見報道。本研究系統比較評估3種傳感器對紐荷爾臍橙葉片葉綠素含量檢測模型的優劣，建立不同傳感器的柑橘葉片葉綠素檢測診斷技術方法，為柑橘樹體營養生理與長勢狀況監測提供一種實時、便捷的技術?！緮M解決的關鍵問題】本試驗以 SPAD-502葉綠素儀測定值為葉綠素含量基礎數據，采用Multiplex?Research熒光多酚含量測量儀、普通掃描儀（HP Scanjet G4050）、ASD FieldSpec4地物光譜儀作為信息采集器，建立紐荷爾臍橙葉片葉綠素含量預測模型，對比評價不同傳感器的可行性與預測精度，為構建柑橘園養分精準管理技術體系提供了依據。

1　材料與方法

1.1　試驗設計

以重慶市北碚區歇馬鎮西南大學柑桔研究所（中國農業科學院柑桔研究所）日光溫室內砂培二年生枳砧紐荷爾臍橙為試驗材料，2016年6月單株定植于圓柱體盆缽（規格：上口直徑×高×下底直徑為28 cm×31 cm×22 cm）中，基質為河沙和珍珠巖1∶2混合。試驗共設7個氮水平，施用量為N0（0）、N1（純氮12.5g/株）、N2（純氮 25 g/株）、N3（純氮 37.5 g/株）、N4（純氮50 g/株）、N5（純氮60 g/株）、N6（純氮70 g/株），每個處理10株。施肥處理時間為2016年6月至2016年10月，氮肥采用含氮量為46%的尿素，每月施總量的五分之一，其余元素使用改良Hogland營養液補充。2016年11月選取57株生長健康的柑橘植株（覆蓋7個處理），單株采集當年生春梢自頂部起的第3片葉，20片為一個樣本。所有葉片用蒸餾水清洗干凈并擦干，備用。

1.2　數據采集與指標測定

1.2.1反射光譜采集葉片高光譜反射率采用美國ASD公司生產的地物光譜儀FieldSpec 4 Standard-Res室內測定。主要原理是利用植株營養元素的豐缺可直接影響其生理代謝過程，使得葉片內生化成分及其濃度產生差異，引起生化成分的化學鍵的振動情況不同，在可見-近紅外波段范圍內表現出特別的光譜特性，進而快速測定樣品中的元素含量。波長范圍 350—2 500 nm，光譜分辨率3 nm@700 nm、10 nm@1 400/2 100 nm，采樣間隔1.4 nm@350—1 025 nm、2 nm@1 025—2 500 nm，共2 151通道，掃描時間100 ms。使用葉片夾裝置采集葉片光譜信息，測量前采用標準黑板進行儀器暗電流校正以及標準白板標定。每個單葉重復采集 3次光譜曲線，每次光譜采集設置為 10條曲線，將每個樣本所有采集的30條曲線取平均值作為該樣本的最終光譜值。

1.2.2圖像信息獲取使用惠普掃描儀（HP Scanjet G4050）作為信息采集器，主要原理為植物葉片顏色的變化實質上是植物體內葉綠素及其他色素含量變化引起的。葉片的顏色與葉綠素含量有著密不可分的關系，故人們往往把葉片顏色變化作為判斷作物營養和缺素癥發生的直接依據。本試驗掃描參數設置為每英寸 300像素，24位顏色深度。用 Adobe Photoshop CS6軟件提取葉片圖像的R、G、B參數值，并對R、G、B進行各種形式的變換組合，作為顏色特征參數。同時對R、G、B值進行歸一化處理，即色度坐標r、g、b，消除不同環境條件下光強等差異所造成誤差的顏色分量，其中r、g、b的計算公式分別為：r=R/(R+G+B)，g=G/(R+G+B)，b=B/(R+G+B)，且 r+g+b=1[15]。

1.2.3熒光參數獲取葉片紫外-可見光熒光信息采用法國Force-A公司研制生產的手持式植物熒光及多酚含量測量儀Multiplex?Research測定。主要原理為利用多酚物質和葉綠素對特定波長光的吸收和反射特性，測出其在植物中的含量。該儀器有紫外（UV，375 nm）、藍（B，470 nm）、綠（G，516 nm）、紅光（R，630 nm）4個激發通道，藍光（BGF，447 nm）、紅光（RF，685 nm）、遠紅外光（FRF，735 nm）3個探測通道[16-17]。其中紅光激發光透過表皮，在葉綠素中激發出近紅外熒光，紫外光或藍綠光被表皮中多酚物質部分吸收，并激發出少量葉綠素熒光，在不同激發光和熒光的組合下獲得12種測量參數，以及自身程序運算后得到36個參數。根據測定環境光強選擇LEDs功率大小，由于為室內測試，設置LEDs功率大小為cfg2。測定過程葉片完全覆蓋采樣孔，且避免陽光或燈光等外源直射光源進入采樣孔內，每個樣本所有單葉片熒光值取平均值分析。

1.2.4葉綠素含量測定每片葉片樣本采集完光譜信息后立即使用日本 MINOLTA公司研制生產的SPAD-502型葉綠素計測定葉綠素含量，每片葉測定10個部位（避開主葉脈）的SPAD值，取其平均值作為該葉片的葉綠素含量。

1.3　數據處理

葉片光譜反射率由美國ASD（Analytical spectral devices, Boulder，USA）RS3和ViewSpecPro軟件采集轉換獲得。因光譜信號容易受到測量環境和儀器性能等因素的影響，為減少光程變化、樣品粒度、基線平移與旋轉可能對模型建立的干擾，利用Unscrambler V9.7（CAMO AS，Oslo，Norway）對原始光譜數據進行移動平滑（MAS）、一階導數光譜（FDS）、二階導數光譜（SDS）、多元散射校正（MSC）、歸一化（Normalize）、標準歸一化處理（SNV）、Noise以及相互組合等方法進行預處理[18-19]。其他數據采用Microsoft Office Excel 2010、Matlab2010b統計分析。

1.4　模型構建與精度評價

將Multiplex?Research葉片熒光值、地物光譜儀FieldSpe4光譜值、圖像色彩參數值作為自變量，分析其與葉片相對葉綠素含量的數學關系，并使用偏最小二乘法（partial least squares，PLS）及內部交叉驗證方法建立葉片葉綠素含量預測模型，并檢驗模型的擬合度。偏最小二乘法（PLS）是基于線性回歸方式的多元校正方法，可消除噪聲，解決光譜共線問題，有效地提取光譜信息，綜合多元線性回歸、典型相關分析和主成分分析等優勢，是化學計量中最普遍使用的定量分析法[20-21]

本試驗所采用的模型性能優劣評價指標為主成分數（principal components）、相關系數（correlation coefficient，r）、交叉驗證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSE-CV)、預測均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSE-P）、平均相對誤差（mean relative error，MRE）和殘余預測偏差（residual prediction deviation，RPD）即測定值標準差與標準預測誤差的比值[22-23]。r和RPD反映出預測值與實測值之間的相關性強度，RMSE和MRE反映出預測值與實測值之間的偏差。r和RPD的值越大、MRE值越小，表明模型的穩定性與可靠性越好、預測能力越強。且當 RPD＞2時，表明模型具有很好的預測能力；1.4＜RPD＜2.0時，說明模型可對樣品做粗略估算；RPD＜1.4時，表明模型無法對樣品進行預測[24]。

2　結果

2.1　不同氮處理對紐荷爾臍橙葉片葉綠素含量的影響

不同氮處理紐荷爾臍橙葉片的 SPAD值的測定結果如圖1所示。結果表明，N2處理的葉綠素含量顯著高于其他處理。相比于N0處理，增施氮肥可顯著提高紐荷爾臍橙葉片葉綠素含量。隨著氮肥施用量的增加，在一定范圍內葉片葉綠素含量呈遞增趨勢，N2處理達到最大值，此后隨著氮肥施用量的增加，葉片葉綠素含量呈遞減趨勢。本試驗將所有樣本通過Matlab2010b GUI_SPA Kennard-Stone（K-S）分類法[25]，按照校正集∶預測集=3∶1隨機分配，其中校正集樣品的SPAD值范圍為69.1—85.6，預測集樣品SPAD值范圍為73.3—85.1，預測集樣本葉綠素含量均在校正集樣本含量范圍之內，可以用于模型預測及精度檢驗。

圖1　不同氮處理的紐荷爾臍橙葉片葉綠素含量Fig. 1　The SPAD values of Newhall Navel Orange leaves under different N treatments

2.2　基于高光譜反射率的紐荷爾臍橙葉片葉綠素反演

葉片是制造光合產物的重要來源，植物氮素的豐缺直接影響生理代謝過程，引起不同的化學鍵振動情況，致使不同波段上光譜反射率存在差異。圖2為不同氮處理的葉片反射光譜數據分別作平均處理所得到的曲線圖，其中波段400—700 nm為植物葉片的強吸收波段，反射率很低；由于葉綠素在紅波段的強吸收和近紅外波段的多次散射，在700—800 nm波段形成高反射平臺的過渡區域；910—2 350 nm存在植物葉片中水分、蛋白質、氮素、淀粉等生物化學成分的吸收特征。由圖2可看出，不同氮處理的各波段的反射光譜曲線動態變化趨勢相同，但某些波段區域存在一定的反射強度差異。其中，N5處理的葉片光譜反射率均值在500—650 nm、1 100—1 300 nm、1 410—2 500 nm左右明顯高于其他處理。在500—650 nm各氮處理葉片反射率存在明顯差異，且隨著葉綠素含量的升高呈遞減趨勢。因此，可通過葉片葉綠素含量光譜響應特征，采用化學計量學方法建模對未知樣品葉綠素含量進行預測。

將所有葉片的高光譜數據經過8種預處理方法轉換，建立葉綠素含量的偏最小二乘回歸模型，所有模型預測精度結果如表1所示。從表1可以看出，部分預處理后的光譜數據建立模型，預測集相關系數顯著提高。但并不是所有預處理都可以提高模型精度，如Noise法所建模型效果相對于原始光譜數據所建模型較差。綜合多指標可得出以FD法建立的反演模型效果最優，模型精度高，可以較好預測紐荷爾臍橙葉片葉綠素含量。

通過全波長特征波段的篩選，采用特征波段建?？捎行p少模型輸入量，減少冗余信息，提高模型運行效率[26]。相關性分析是確定地物特征波段的重要方法之一，對比分析所有不同預處理方法建立的模型精度，采用最優預處理FD法轉化后的光譜數據進行特征波段的篩選。圖3顯示了FD預處理法全波段光譜數據與紐荷爾臍橙葉片葉綠素含量相關性曲線，結果表明，經FD預處理后全波段光譜數據與紐荷爾臍橙葉片葉綠素含量相關性曲線在532 nm、586 nm與705 nm附近出現明顯高峰，且相關系數均達0.8以上，達極顯著相關。選擇此3個波長作為特征波長構建 PLS模型，其中校正集 rc=0.834，RMSE-CV=2.390，預測集 rp=0.940，RMSE-P=1.851，MRE=1.80%，RPD=3.801。

表1　紐荷爾臍橙葉片SPAD值反射光譜預測模型結果Table 1　The model accuracy of SPAD value based on hyperspectral reflectance

圖2　不同氮處理的紐荷爾臍橙葉片光譜響應特征Fig. 2　The spectral characteristics of Newhall Navel Orange leaves under different treatments

2.3　基于熒光值的紐荷爾臍橙葉片葉綠素反演

表2為Multiplex?Research測得的葉片熒光參數值與SPAD值的相關系數結果。從表2可以看出，共有8個熒光參數值與葉片SPAD值達到了極顯著相關關系，其中 FRF_B（藍光激發的紅外熒光）、RF_G（紅光激發的紅色熒光）、FRF_G（綠光激發的紅外熒光）、RF_R（綠光激發的紅色熒光）、FRF_R（紅光激發的紅外熒光）、FER_RG（紅光激發的紅外熒光）與SPAD值呈負相關，SFR_G（綠光激發的簡單熒光比率）、SFR_R（紅光激發的簡單熒光比率）與SPAD值呈正相關。

圖3　紐荷爾臍橙葉片高光譜反射率與葉綠素含量的相關系數圖Fig. 3　The correlation coefficient of reflectance and chlorophyll content of Newhall navel orange leaves

表2　熒光特征參數與紐荷爾臍橙葉片SPAD的相關性Table 2　The correlation of characteristic fluorescence parameters and SPAD value of Newhall Navel Orange leaves

Multiplex?Research測得的SFR參數主要用來衡量葉綠素含量，采用與葉綠素含量相關性較高的SFR-G熒光值建立PLS模型，所得結果并不理想，其MRE=16.21%、RPD=0.995、rc=0.683、rp=0.594，不能較好估測紐荷爾臍橙葉片葉綠素的含量。將篩選得到的8個熒光特征參數全部作為自變量建立葉綠素含量SPAD值多元線性回歸PLS反演模型，并進行模型精度檢驗，其 RPD=4.807、MRE=2.37%、rc=0.767、RMSE-CV=2.731、rp=0.930、RMSE-P=1.986，無論校正集還是預測集的相關系數均較高、預測集MRE較低、RPD較大，故利用特征熒光參數建立模型可以對葉綠素含量SPAD值進行較好的預測，且模型精度較高。

2.4　基于R、G、B等圖像色彩參數的紐荷爾臍橙葉片葉綠素含量反演

一般圖像處理中常用RGB或HIS兩種彩色系統，具有對光源變化不敏感、不同顏色易于區分的特點[27]。故本研究對所有試驗樣本利用Photoshop CS6圖像分析處理，提取紐荷爾臍橙葉片掃描圖像的RGB，R、G、B均值，并對R、G、B進行各種形式的變換得到25個色彩參數，以此作為圖像的顏色特征信息。同時分析葉片各色彩參數值與葉綠素值 SPAD值的相關性，結果如表3所示。從表3可以看出，本試驗所選用的25種顏色特征信息都與葉片SPAD值呈顯著或極顯著相關，相關系數r均大于0.325（n=57，r0.01=0.325）。其中 b、R/G、B/G、B/R、B/(G+R)、B-R、(B-R)/(B+R)、r-g參數與SPAD值呈負相關，其余參數與SPAD值呈正相關，且對顏色參數R、G、B值進行歸一化等變換后獲得的大部分參數與SPAD值的相關性均有所提高。

利用所有特征參數建立PLS多元回歸模型，精度較優于其他模型，MRE僅為1.73%，可較好的預測葉片葉綠素含量。為減少模型輸入量，提高運算速度，選用與SPAD值相關系數在0.7以上的16個參數分別建立一元與多元回歸模型，結果如表4所示。利用特征參數分別建立葉片葉綠素含量反演模型，MRE均低于5%、RPD均在2以上，表明所建模型均能較好地預測紐荷爾臍橙葉片葉綠素含量，且綜合多個評價指標可以得出以G-B參數建立的模型最優。

表3　數字圖像獲取的圖像色彩參數與紐荷爾臍橙葉片SPAD值的相關系數Table 3　The correlation of color parameters and SPAD of Newhall Navel Orange leaves

表4　紐荷爾臍橙葉片SPAD值與圖像色彩參數回歸模型及精度Table 4　The estimation models and accuracy for SPAD of Newhall Navel Orange leaves based on color characteristic

3　討論

本試驗所采用的3種不同的傳感器FieldSpec4地物光譜儀、數字圖像技術、Multiplex?Research熒光多酚含量測定儀檢測紐荷爾臍橙葉片葉綠素含量，結果表明，三者預測精度較高，平均相對誤差均在5%以下；其中，利用FieldSpec4地物光譜儀采集葉片光譜反射率，經預處理后構建模型進行葉片葉綠素含量預測，結果表明，光譜預處理對模型預測效果有一定的影響，且并非所有預處理都可以提高模型精度。其中預測葉片葉綠素含量最優的光譜預處理方法為“FD”，并篩選得到3個特征波段，他們與葉片葉綠素含量呈極顯著相關。這與王錦堅等[28]、丁永軍等[29]利用紅邊（680—750 nm）、綠峰（550 nm左右）特征研究柑橘葉片葉綠素含量的結果一致。利用Multiplex?Research特征熒光參數構建的葉片葉綠素含量預測模型，主要利用熒光原理測定葉片葉綠素含量，其模型精度較高?；跀底謭D像分析技術的紐荷爾臍橙葉片葉綠素含量檢測結果與易時來[9]、柴阿麗[27]、王娟[30]等的結果基本一致，利用歸一化色度坐標與數學變換后的多種參數建立的模型均可較好地預測葉片葉綠素含量，但所篩選的具體特征參數略有差異。該差異是否與紐荷爾臍橙葉片具有蠟質層結構、葉片成熟度或者圖像信息采集方式有關，還有待進一步研究。

利用以上3種傳感器及其檢測技術均可較好的預測紐荷爾臍橙葉片葉綠素含量，但各有利弊。FieldSpec4地物光譜儀光譜信息豐富，可用于多種成分檢測，但受光照影響較大，在兩次白板校正之間光照的微弱變化可能會導致結果的差異，得到的光譜信息也需要經過預處理等變換才能較好的反演葉綠素含量，操作不太輕便；但采用室內測定單葉片光譜反射率有較大優勢，通過內置光源葉片夾裝置夾持葉片進行測定，測量面為直徑21 mm圓面，測定環境密封相對穩定，且儀器內置光閘及DriftLockTM自動漂移修正，可以通過RS3軟件監視探測器暗電流漂移，連續地調整暗電流噪音補償，有效消除波長大于1 000 nm范圍內由于探測器暗電流造成的與熱漂移相關的巨大誤差，適用于葉綠素含量狀況和其他物質含量狀況的綜合比較，同時獲得葉綠素與礦物元素含量指導營養診斷。相比于其他兩種方法，該方法控制環境穩定，預測模型精度高。本研究所涉及的數字圖像技術，掃描儀作為核心部件，采用 CCD光電耦合器作為圖像傳感器，自帶冷陰極熒光燈作為照明設備，發光均勻穩定結構強度高；與普通數碼相機等傳感器相比，其便捷性較差，但其成本低、測定環境相對穩定、操作簡單，適宜于室內大批量葉片葉綠素含量的測定。Multiplex?Research熒光多酚含量測定儀便攜快速，內置3級功率光源，除了雨天均可室外采集葉綠素信息，極大程度地避免光強變化導致的誤差，除葉綠素外也可反映出葉片氮素營養和花青素、多酚類等物質含量；便攜程度優于地物光譜儀、數字圖像技術等設備，但測量指標相對專一、預測精度也不及前二者。針對3種傳感器建立紐荷爾臍橙葉片葉綠素含量與不同傳感器測量值對應檢索表，達到真正快速便捷、市場化應用，是我們今后的重要研究目標。

4　結論

采用 FieldSpec4地物光譜儀獲取葉片光譜反射率，以532 nm、586 nm、705 nm波段光譜信息經FD預處理法后建立的葉片葉綠素定量反演模型的預測精度最優，MRE僅為1.80%，RPD=3.801。

數字圖像采集的圖像色彩參數所建模型預測精度在本試驗中排名第二，以所有特征參數建立的PLS多元線性回歸模型以及G-B參數建立的一元二次回歸模型（Y=0.0269x2-1.4702x+87.782）預測精度最優，MRE分別為1.98%，RPD=3.946。

Multiplex?Research測得的葉片熒光參數所建立的模型精度相對較差，但以8個特征熒光參數值全部作為自變量所建立的PLS模型最優，MRE為2.37%，RPD=4.807。

本試驗所提到的3種傳感器均可應用于紐荷爾臍臍橙葉片葉綠素含量的估測，具體可根據檢測成本以及便捷性等需求選擇適用的儀器。

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