雞脾臟重全基因組關聯分析

沈曼曼，曲亮，竇套存，馬猛，郭軍，盧建，胡玉萍，李永峰，王克華

（江蘇省家禽科學研究所，江蘇揚州 225125）

0　引言

【研究意義】提高家禽的抗病力，進行抗病育種是家禽育種工作者研究的熱點。隨著分子標記技術的發展，已鑒定出了影響雞經濟性狀的諸多 QTL區域，對抗病力的研究也在持續進行。脾臟是家禽重要的免疫器官，是機體對外界抗原起免疫反應的主要場所，常用于衡量家禽免疫機能的重要指標[1]，動物隨著年齡和機體免疫狀態脾臟大小也有很大的變化。2010年伊莎公司提出了“100周齡500個蛋”的計劃[2]，目前在下韋爾特一個農場讓這一計劃成為現實，每只母雞100周齡產蛋數達500.5個[3]。蛋雞產蛋周期的延長可以降低生產成本，提高生產效益，而產蛋后期母雞的健康狀況將是影響這一目標實現的重要因素[4-5]。因此研究母雞產蛋后期的免疫器官分子標記，對蛋雞產蛋持久性具有間接的影響作用，可為產蛋后期母雞的生存狀況提供重要的理論指導。【前人研究進展】張磊等[6]利用 60K芯片技術對北京油雞100日齡脾臟進行GWAS分析，發現16個SNP位點與脾臟重顯著相關，分布于8條染色體上，并將鑒定到 JAK1、ZDHHC8、VAV3、SATB1候選基因。TER?I?等[7]利用 QTL作圖對由體重雙向選擇構建的資源群體的F3代55日齡脾臟重進行研究，結果發現影響脾臟重的區域位于5號染色體13 cM位置?！颈狙芯壳腥朦c】不同研究者對雞脾臟重的研究多采用青年雞，目前尚無對成年雞產蛋后期脾臟重的GWAS進行分析。【擬解決的關鍵問題】基于 1 501只由東鄉綠殼蛋雞和白來航蛋雞構建的F2代資源群體，利用600 K SNP芯片進行基因型檢測，對72周齡母雞脾臟重進行全基因組關聯分析，鑒定影響脾臟重的QTL區域，并基于基因芯片分析脾臟重的遺傳參數，以期為提高母雞雞產蛋后期的健康狀況提供參考依據。

1　材料與方法

試驗在中國農業科學院江蘇省家禽科學研究所進行，血液DNA的提取在中國農業大學進行，600 K SNP基因芯片分析在Affymetrix公司進行。F2代母雞群體飼養至72周時屠宰取脾臟稱重。

1.1　試驗動物

以揚州翔龍禽業發展有限公司飼養的東鄉綠殼蛋雞和單冠白來航雞為親本構建的 F2代母雞群體為試驗素材，資源群體構建及來源參見文獻[8]。構建方式主要為以下方式：F0代由白來航公雞（WL）和東鄉綠殼蛋雞母雞（DX）進行正反交雜交產生F1代，F1代共計1 581只，其中正交（DX♂×WL♀）后代552只，反交（WL♂×DX♀）后代1 029只。以F1代為基礎組建49個家系，其中25個家系以父系半同胞方式組建，交配的公雞和母雞間為半同胞關系并避免全同胞，分別有12個和13個家系來自于正交群體和反交群體；另外24個家系要求與配公母無血緣關系，來自于正交群體和反交群體的家系分別為11個和13個。同批出雛F2代3 749只，其中公雞1 856只，母雞1 893只。各代均有詳細的系譜記錄，三代共統計有2 447個個體，其中用于本試驗統計的F2代群體母雞為1 501只。試驗過程中飼養管理條件一致，自由采食和飲水，產蛋期單籠飼養，按常規程序免疫，健康狀況良好。采翅下靜脈血ACD抗凝用于DNA提取。72周齡統一屠宰，取脾臟后稱重。

1.2　方法

1.2.1性狀表型值處理進行GWAS分析的數據需要符合正態分布，因此首先對脾臟重利用 SAS的univariate模塊進行Shapiro-Wilk正態性檢驗。

1.2.2基因組 DNA提取及質控經翅靜脈采集所有F2代個體血液，ACD抗凝后利用酚-氯仿法提取基因組DNA?；蚪MDNA利用 600 K Affymetrix Axiom Chicken Genotyping Array[9]進行基因分型。利用APT軟件（http://affymetrix.com/）對數據篩選進行下一步分析，進行分型前的質量控制分析，采用axiom_dishqc_DQC進行質控，保留DQC≥0.82進行后續SNP分型；刪除call rate小于97%的個體。SNP初步質控后，然后利用PLINK1.90[10]軟件包進行數據前處理分析，剔除檢出率＜95%，次等位基因頻率＜0.01、偏離哈代溫伯格P＜10-6的SNP標記。BEAGLE v4.0[11]進行基因型填充分析，選擇 R2＞0.5的 SNPs進入填充。最終得到1 501只個體和435 867個SNPs進行后續分析。

1.2.3全基因組關聯分析為了消除群體分層可能導致的假陽性出現，在全基因組關聯分析前，首先利用PLINK通過獨立配對法對所有SNPs進行多維度主成分分析。利用PLINK軟件計算成對SNP的r2值，高于0.2則剔除1個標記，計算內部成對SNP的r2值，并以5個SNPs為單位進行步移檢測，以前5個主成分作為協變量加入到全基因組關聯分析模型中。利用R腳本程序“simpleM”方法[12]計算由于各SNPs位點獨立檢驗估計，共得到59 308個indepSNPs，然后進行 bonferroni校正，計算出基因組顯著水平和潛在顯著水平閾值分別為8.43×10-7（1/59308）和1.69×10-5（0.05/59308）。

利用GEMMA軟件[13]進行全基因組關聯分析。利用單變量混合線性模型對脾臟重進行全基因組關聯分析，計算公式如下：

式（1）中，y代表所有個體的表型性狀的n×1向量值；W指協變量矩陣（指包括一列向量1和5個主成分的固定效應），α為包括截距在內對應系數的一列向量，Wα代表群體結構效應；x為標記基因型向量，β標記位點效應的大小，xβ代表SNP的效應；u為個體的隨機效應向量，u～N（0, KVg），K代表由 SNP標記計算出的已知的 n×n遺傳關系矩陣，Vg多基因加方差；ε代表n×1隨機誤差向量，符合ε～N（0, IVe）分布，I代表n×n身份矩陣，Ve代表殘差組分。

本次研究中主要利用Wald測驗作為GWAS分析顯著統計指標。

為了判斷有無假陽性的出現，利用 R軟件包GenABEL[14]計算基因膨脹系數λ。由于λ隨著群體樣本規模的增加而增大，因此通過樣本規模1000來計算校正的λ值。

式（2）中 Ti2代表 Wald估計值在零假設下漸近符合自由度為1的卡方分布，0.455是在零假設下假設沒有關聯的期望中位數。

式（3）中n代表總樣本量，λ代表總樣本量的估計值。

全基因組關聯分析曼哈頓圖和QQ圖R軟件中由“gap”和“qqman”并修改相應參數繪制完成[15]。

1.2.4連鎖不平衡分析由于基因間的連鎖關系導致在一個區間內許多SNPs在全基因組關聯分析中被檢測均具有顯著效應。為了區分由于連鎖不平衡造成的假陽性，將候選SNP位點的基因型作為協變量，重復1.2.3中GWAS分析。經條件分析后，原先顯著的SNP位點均不顯著時即將該位點作為候選位點篩選候選基因。

1.2.5基于SNP數據的遺傳參數計算將質控后的SNPs數據利用PLINK處理成GCTA v1.24[16]處理格式。然后利用GCTA v1.24軟件的單性狀REML方法估計脾臟重的遺傳參數。同時計算候選SNP位點對性狀表型方差的貢獻率（CPV）以及各染色體對脾臟重解釋的表型方差。

1.2.6基因注釋將分析得到的顯著 SNP位點查找Ensembl和NCRI上Galgal4 assembly序列，按照SNP突變位點所在區間選擇候選基因，以“有義突變”、“cds區”、“外顯子區”、“UTR”、“內含子區”、“下游上游”的原則順序選擇候選基因進行分析[17-18]。

2　結果

2.1　脾臟重表型值和遺傳力統計

脾臟重的型值和基于芯片計算的遺傳力見表 1。由表知脾臟重的平均值在 1.64 g，其變異系數為48.36%，說明在 72周齡老雞的脾臟重存在很大的差異。其遺傳力為0.236，為低遺傳力性狀。

表1　脾臟重表型數據和遺傳參數Table 1　Descriptive statistics and hertibilty for spleen weight in the F2population

2.2　全基因組關聯分析

對脾臟重進行全基因組關聯分析后發現達到基因組顯著水平的SNP位點共412個，見表2和圖1。分別有383個和29個位于1號和28號染色體上，同時這兩條染色體上分別有242個和34個潛在性顯著水平。在4號和16號染色體上分別有3個和2個潛在性SNP位點。λ是判斷群體是否存在分層的參數，一般在1.05以上說明群體存在分層，不適宜進行全基因組關聯分析。由本研究圖1-B的QQ圖知，群體的λ值為1.042，說明所有個體均勻分布，不存在群體分層現象。

圖1　脾臟重全基因組關聯分析曼哈頓圖和QQ圖Fig. 1　Manhattan plot and QQ-plot of genome-wide association

表2　與脾臟重顯著和潛在顯著關聯SNP位點信息Table 2　Number and distribution of significant and suggestive SNPs association with spleen weight

染色體1號和28號上鑒定出的較多SNP位點可能是由于連鎖不平衡造成，而通常有義突變更容易造成較大的表型改變，因此首先以SNP位點在CDS區間作為候選基因，通過查找 glagal4參考基因組序列后，顯著和潛在顯著的 SNPs沒有位于編碼區序列。而UTR區域的突變可以改變順式調控元件，從而影響mRNA翻譯和轉錄效率的穩定性[19]，本研究因此選擇了1號和28號染色體上位于UTR-3區域的SNPs作為候選位點在1號染色體上發現有4個SNPs位點位于UTR-3區（表3），分別位于基因CCDC122、KCTD4、SLC25A30和SUCLA2區間內。28號染色體為1個SNP位點位于PCASP2基因的UTR-3區，因此選擇這5個SNP位點作為候選位點進行初步分析。同時將4號和28號的潛在顯著性SNPs參照參考基因組，篩選距離最近的基因作為候選基因。

對1號和28號的5個SNP位點以及4號和16號的潛在顯著性位點進行位點CPV計算，結果見表3，由表知以1號染色體上顯著位點解釋的CPV均最大，最高的是位點rs314001986，解釋了5.91%的表型方差，因此將rs314001986作為1號染色體的候選位點進行條件分析。同時對28號染色體上位點rs312729296進行條件分析。以判斷在各位點之間的顯著性是否由連鎖不平衡造成，對1號和28號染色體以rs314001986和rs312729296候選位點進行條件分析后結果顯示原先顯著的位點均不顯著（圖2）。對4號和16號染色上潛在的顯著位點進行連鎖不平衡分析結果見圖3，由圖知4號和16號上潛在性顯著位點均存在著較強的連鎖不平衡狀態。

綜合上述分析，最終以rs314001986、rs312729296、rs315270535和 rs314065899作為候選 SNPs進行基因注釋分析。根據參考基因組glagla4可知，這4個位點分別位于基因KCTD4（potassium channel tetramerisation domain containing 4，鉀離子聚合結構域）、PCASP2（mucosa associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene 1-like，黏膜相關性淋巴樣組織）UTR-3區域內、以能LDB2（LIM domain binding 2，LIM 結構域結合基因）和 HEP21（hen egg protein 21，卵清組成蛋白）內含子區域內。

表3　脾臟重顯著和潛在性SNP位點信息Table 3　Information of significant and suggestive mutations association with spleen weight

圖2　1號和28號染色體顯著位點條件分析Fig. 2　Regional plot for conditional analysis about significant loci on GGA1 and GGA28

圖3　4號和16號染色體上潛在性顯著位點LD分析Fig. 3　LD analysis about suggestive loci on GGA4 and GGA16

分別對 1號和 28號染色上候選 SNPs位點rs314001986和 rs312729296在各個體上的基因型對應的表型分析見圖4。由圖4可知兩個SNP的純合子基因型 G/G對脾臟重均具有增重效應。rs314001986位點 3種基因型對應的表型之間存在極顯著差異，rs312729296三種基因型為兩個純合子存在極顯著差異。

2.3　染色體遺傳力

利用GCTA軟件對染色體的遺傳力和染色體長度進行分析結果見圖 5。每條染色體的遺傳力和其長度的相關系數為 R2=0.386，為中等極顯著相關（P=1.50×10-4），1號染色體的遺傳力最大為9.25%，其次為28號染色體為4.55%（圖5-A）。將用于條件分析的位點SNPs作為協變量后重新計算染色體遺傳力，1號染色體的遺傳力變為 4.03%，28號染色體變為2.05%（圖5-B），而其他染色體的遺傳力均幾乎未變。

圖4　rs314001986和 rs312729296在各個體上基因型與表型關聯分析Fig. 4　Relationship between genotype and phenotype on rs314001986 and rs312729296

3　討論

前人利用關聯分析或 QTL定位對脾臟重進行研究，多以青年雞為研究對象[6,20]。隨著“100周齡500個蛋”的計劃實現，研究母雞產蛋后期的健康狀況尤為重要。本研究首次利用600 K高密度基因芯片對母雞產蛋后期的脾臟重進行全基因組關聯分析，研究發現4個QTL區域與脾臟重顯著或潛在性關聯。其中有412個顯著性SNP位點和281個潛在性SNP位點，在1號、28號、4號和16號染色體上均有分布，其中以1號染色體上分布最多，且 1號染色體的遺傳力為9.23%。PARK等[20]研究對 70日齡雞脾臟重的 QTL定位發現，10號和11號染色體對脾臟重解釋遺傳力在分別為3.9%和2.8%，均較本研究中4、16和28號染色體上區域要高，而低于本研究中1號染色體的顯著區域的遺傳力（圖5-B）。1號染色體上與脾臟重顯著關聯的區域在165—173 Mb區間，在本研究群體發現也是影響蛋重、卵巢重和飼料消耗[8,21-22]的重要區域，而在其他研究也發現與體重具有重要關系[23-24]，說明1號染色體170 Mb左右的區間是影響雞生長的重要QTL區域。張磊等[6]研究發現影響100日齡脾臟重的顯著性 SNP位點分布于 1、2、3、4、13、18、19和25號染色體上。本研究中所定位到的關聯區域與上述不同，代表了新的影響脾臟重的QTL區域或位點，然不同品系間以及不同時期可能會表現出不同的病原免疫應答反應[25]，本研究中所得到的QTL區域需要進一步進行功能驗證篩選。

本研究中，1號染色體中共有383個SNPs位點達到基因組顯著水平，對顯著水平最高的 SNP位點rs314001986進行條件分析后原顯著的位點均不顯著，以rs314001986作為候選位點，該位點位于KCTD基因 UTR-3區域。KCTD蛋白參與離子運輸過程[26]，KCTD家族中含有26個成員，均具有保守的N端結構和鉀通道四聚化結構域，參與了Wnt/beta-catenin、FGF、PPAR等信號通路，在許多生物過程和疾病中發揮作用，KCTD4在人神經母細胞瘤中上表達[27]。對雞的生物學作用以及參與的免疫調控尚不清楚，根據上述170 Mb區間可能是影響雞各性狀“重量”的區域，KCTD4有可能是促進脾臟增殖等作用，其作用機理有待于進一步研究。

張磊等[6]發現影響脾臟重的4號染色體SNP位點在62.8 Mb區間，本研究得到的76 Mb區間與其研究不同，本研究對張磊研究中得到的 SNP位點（rs14479254）與本研究中位點rs315270535進行連鎖不平衡分析發現兩個位點之間不存在連鎖不平衡（D’=0.5, R2=0.05），可能在4號染色上存在兩個區域影響脾臟重。本研究中位點rs315270535位于LDB2基因的UTR-3區域，LDB2 基因能夠與多種轉錄因子結合，在腦的發育和血管形成過程中發揮重要作用，與人的動脈瘤疾病相關。吳丹[28]對北就油雞的全基因組關聯分析發現 LDB2基因下游 108 kb的一個SNP位點與 100日齡體重潛在關聯，GU等[29]也發現LDB2與雞7—12周體重顯著關聯并與6—12周平均日增重相關。在發生細胞免疫和體液免疫時，脾臟組織通過脾細胞增殖功能使淋巴小結增生或脾索內漿細胞及巨噬細胞顯著增加進行免疫應答，綜上，1號和 4號染色體上發現的顯著和潛在性顯著SNPs以及相關候選基因可能均參與了免疫應答過程中的脾臟增殖作用。

本研究在16號和28號染色體得到的潛在和顯著性QTL區域為首次發現。而其中與免疫系統密切相關的大部分主要組織相容性復合體（MHC）基因位于16號染色體上（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene），可能16號的潛在顯著區間參與了MHC在轉錄或轉錄后調控上發揮作用，以進一步增強免疫功能。其潛在性SNP位點rs314065899位于HEP21（hen egg protein 21）內含子區間，HEP21卵清組成蛋白[30]，隨著輸卵管發育成熟而上調，HEP21同時參與胚胎孵化過程中的一些免疫反應[31]，由此推測HEP21可能參與到脾臟的免疫應答過程。

28號染色上影響脾臟重的區域位于 0.47—1.27 Mb區間內，篩選到的 SNP位點 rs312729296位于PCASP2基因UTR-3區域，PCASP2是MALT家族之一，MALT1（黏膜相關淋巴組織淋巴瘤轉運蛋白1）基因在人上參與了先天免疫以及炎癥反應，參與了NF-кB的激活過程。這個家族常見的有基因PCASP1、PCASP2和 PCASP3，PCASP2在人類基因上已經消失，然在雞基因組上仍起作用[32]。本研究推測在雞上PCASP2可能發揮了與哺乳動物上MALT1一致的作用，具有參與炎癥反應的功能。

4　結論

本研究利用高密度基因芯片，對蛋雞72周齡脾臟重進行了全基因組關聯分析，共發現了412和281個SNPs位點與脾臟重顯著和潛在顯著關聯，分別位于1、28、4和 16號染色體上，篩選到 KCTD4、LDB2、HEP21和PCASP2候選基因。并利用生物信息學分析方法得到1號染色體解釋的遺傳力為9.25%，脾臟重的遺傳力為0.236。

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