大麗輪枝菌弱致病力菌株Vd171對(duì)棉花黃萎病的誘導(dǎo)免疫作用及機(jī)制

張一豪，馮鴻杰，袁媛，靳羽瑩，師勇強(qiáng)，張朝軍，李付廣

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽 455000）

0　引言

【研究意義】棉花是中國重要的經(jīng)濟(jì)作物，黃萎病是棉花生產(chǎn)上的一種毀滅性病害，嚴(yán)重影響棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)，是發(fā)展棉花生產(chǎn)的重要限制因子之一，目前仍無較為有效的防治方法。在缺乏有效的防治藥劑、抗病品種匱乏的情況下，探索其他途徑來提高棉花品種的抗病性，從而將黃萎病造成的產(chǎn)量損失控制在經(jīng)濟(jì)閾值之下，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】棉花黃萎病是一種典型的土傳維管束病害，其病原菌為大麗輪枝菌（Verticillium dahliae），在土壤中以微菌核或菌絲體形式長期存活，從植株的根部入侵定殖后，沿維管束擴(kuò)展蔓延。該病具有病原菌寄主范圍廣、傳播途徑多、遺傳分化復(fù)雜，防治難度大的特點(diǎn)。種植抗病品種是防治土傳維管束病害最經(jīng)濟(jì)有效的措施之一，但目前中國棉花抗黃萎病育種尚未取得顯著進(jìn)展，主要原因是：（a）棉花對(duì)黃萎病的抗原匱乏；（b）棉花對(duì)黃萎病的抗性是受多基因控制的數(shù)量性狀，抗病育種難度大；（c）棉田黃萎病菌系是一個(gè)復(fù)合種群, 而且基因水平也存在差異，變異頻繁，品種抗性喪失快[1-3]。目前，通過誘導(dǎo)免疫提高植物的抗病性，成為植物病害防治研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。有不少的研究表明，利用弱毒菌株或非致病菌能激活寄主的免疫系統(tǒng)，從而增強(qiáng)寄主的抗病性[4]。但在棉花黃萎病方面的研究報(bào)道較少。20世紀(jì)70年代 MACE[5]發(fā)現(xiàn)弱致病力的大麗輪枝菌可誘導(dǎo)棉花對(duì)黃萎病的抗性；吳洵恥等[6]研究認(rèn)為在棉花上接種棉花黃萎病菌弱菌株可減輕后繼感染的強(qiáng)菌株引起的棉花黃萎病的嚴(yán)重度；ZHU等[7]從棉花上分離到一株大麗輪枝菌弱致病力菌株 CVd-WHW（后命名為Vd171），先接種該弱毒菌株之后，再接種強(qiáng)致病力菌株，表現(xiàn)出具有顯著的交叉保護(hù)作用。【本研究切入點(diǎn)】對(duì)Vd171弱毒菌株誘導(dǎo)抗病性的具體機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步明確。【擬解決的關(guān)鍵問題】明確大麗輪枝菌弱致病力菌株Vd171誘導(dǎo)棉花產(chǎn)生抗病性的技術(shù)方法，并通過分析該菌株誘導(dǎo)棉花后，病原菌與寄主的親和性、病原菌在寄主中的擴(kuò)展和寄主防御相關(guān)酶基因的表達(dá)及活性變化等，探明Vd171誘導(dǎo)寄主對(duì)棉花黃萎病產(chǎn)生抗性的作用機(jī)制，從而為進(jìn)一步揭示病原菌與寄主互作機(jī)制和探索棉花黃萎病生物防治新途徑提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

試驗(yàn)于 2015—2017年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所完成。

1.1　供試菌株及棉花品種

大麗輪枝菌弱致病力菌株Vd171（菌株保藏編號(hào)：CGMCC No. 5903），于2009年分離自湖北襄樊棉田有黃萎病癥狀的棉株，大麗輪枝菌強(qiáng)致病力菌株Vd080（菌株保藏編號(hào)：CGMCC No. 5904），于2007年分離自河北辛集棉田有黃萎病癥狀的棉株。兩個(gè)菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)和ITS（internal transcribed spacer）序列鑒定，均為大麗輪枝菌。Vd171前期研究已鑒定為弱致病力菌株，而Vd080為強(qiáng)致病力菌株，并表現(xiàn)為落葉型菌株。

本研究中，用Vd171接種以誘導(dǎo)植株抗病性，用Vd080接種以評(píng)價(jià)誘導(dǎo)抗病性的效果。Vd080GFP為通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將綠色熒光蛋白基因GFP插入Vd080中，經(jīng)篩選鑒定后其致病力與Vd080無差異。

分生孢子懸浮液制備：供試菌株在棉籽培養(yǎng)基上25℃暗培養(yǎng)7 d后取出，加入滅菌水，充分振蕩后，用4層滅菌紗布過濾，收集濾液并將分生孢子濃度調(diào)節(jié)至1×107個(gè)分生孢子/mL備用。

培養(yǎng)濾液制備：供試菌株在查氏培養(yǎng)基上25℃振蕩培養(yǎng)7 d后，用濾紙過濾掉菌絲和孢子，收集濾液備用。

試驗(yàn)所用棉花品種為棉花黃萎病感病品種冀棉 11。

1.2　Vd171對(duì)棉花黃萎病誘導(dǎo)抗性的測(cè)定

棉苗培育方法參照朱荷琴等[8]方法。強(qiáng)致病力菌株Vd080的接種均于棉苗一片真葉平展時(shí)（播種后21 d）進(jìn)行，以分生孢子懸浮液為接種體，采用蘸根接種方法[8]，接種濃度均為 1×107個(gè)分生孢子/mL，蘸根時(shí)間為5 min。

弱致病力菌株Vd171的接種根據(jù)試驗(yàn)需要設(shè)置了不同的接種時(shí)間、接種方法、接種次數(shù)和不同接種體的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，主要包括：①用于明確Vd171接種的最佳時(shí)間。共設(shè)置7個(gè)處理，其中，處理1—4分別為先接種Vd171，2、4、6、8 d后接種Vd080；處理5—7分別為先接種Vd080，1、2、4 d后再接種Vd171；以先接種清水，4 d后接種Vd080為對(duì)照。Vd171的接種方法同Vd080。②用于明確Vd171的最佳接種方法。設(shè)置6個(gè)處理，包括Vd171蘸根、灌根、莖部針刺[9]、葉面噴霧、浸種共5種接種方法和清水浸種對(duì)照。蘸根、灌根和葉面噴霧為每缽Vd171分生孢子懸浮液10 mL，莖部針刺為每棉株0.2 mL，浸種處理采用Vd171的分生孢子懸浮液浸種12 h。蘸根、灌根和葉面噴霧均于接種Vd080前的4 d進(jìn)行，浸種處理于播種前進(jìn)行；5種接種方法 Vd171分生孢子懸浮液的濃度為1×107個(gè)分生孢子/mL。以先清水浸種、后接種Vd080為對(duì)照。所有處理均在播種后21 d蘸根接種Vd080。③用于明確Vd171的接種次數(shù)。設(shè)置3個(gè)處理，先接種Vd171兩次（間隔4 d），第2次接種Vd171后4 d再接種Vd080；接種Vd171一次，接種Vd171后4 d接種Vd080；以接種清水后4 d接種Vd080為對(duì)照。接種方法均為蘸根。④用于明確Vd171分生孢子和培養(yǎng)濾液的誘導(dǎo)抗病效果。共設(shè)置4個(gè)處理，分別為先接種Vd171分生孢子懸浮液、Vd171查氏培養(yǎng)濾液、查氏培養(yǎng)基（對(duì)照）及清水（對(duì)照），所有處理均4 d后接種Vd080。接種方法均為蘸根。

上述4組試驗(yàn)均為每處理3次重復(fù)，每重復(fù)留苗不低于30株。

棉苗置日光溫室中培養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在 20—32℃，土壤相對(duì)濕度控制在60%以上，光照良好。對(duì)照棉苗普遍發(fā)病后，按5級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病害的分級(jí)調(diào)查[8]。計(jì)算病株率、病情指數(shù)和防治效果。病株率（%）=病株數(shù)×100/總株數(shù)；病情指數(shù)=（∑級(jí)數(shù)×每級(jí)的病株數(shù)）×100/（調(diào)查的總株數(shù)×4）；防治效果（%）=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）×100/對(duì)照病情指數(shù)。

1.3　Vd171對(duì)黃萎病菌定殖和棉株內(nèi)擴(kuò)展的影響

采用營養(yǎng)液水培棉苗，播種后12 d左右，一片真葉初現(xiàn)時(shí)，將棉苗根系放入有Vd171分生孢子的營養(yǎng)液中（Vd171孢子終濃度為1×107個(gè)分生孢子/mL），浸泡4 d后，取出棉苗，再浸入含Vd080GFP分生孢子的營養(yǎng)液中（Vd080GFP孢子終濃度為1×107個(gè)分生孢子/mL），以先接種清水后接種Vd080GFP為對(duì)照；每處理3次重復(fù)，每重復(fù)保證不少于50棵棉苗，棉苗置日光溫室中培養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在20—32℃，光照良好。接種Vd080GFP后1、2、3、4 d，每處理隨機(jī)取5棵棉苗，稱取根0.5 g，剪碎，加入2 mL滅菌水，充分振蕩后靜置10 min，取上清液，在熒光顯微鏡下，計(jì)數(shù)分生孢子的數(shù)量；接種Vd080GFP后7 d，每處理隨機(jī)取棉苗10株，將下胚軸分為上、中、下3段進(jìn)行病原菌的分離鑒定。

營養(yǎng)液的配制：6 mmol·L-1KNO3，4 mmol·L-1Ca(NO3)2，2 mmol·L-1NH4H2PO4，1 mmol·L-1MgSO4，50 mmol·L-1KCl，25 mmol·L-1H3BO3，2 mmol·L-1MnSO4，2 mmol·L-1ZnSO4，0.5 mmol·L-1CuSO4，0.5 mmol·L-1H2MoO4，20 mmol·L-1EDTA，20 mmol·L-1Fe(NH4)2SO4。

1.4　棉花防御基因表達(dá)量測(cè)定

棉苗培育及Vd171接種方法同1.2第1組試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)處理，接種Vd080前4 d接種Vd171及清水（對(duì)照）。每處理30個(gè)營養(yǎng)缽，每缽留苗5株。接種Vd171后0、12、24、36、48、72、96 h取樣，每處理隨機(jī)取20棵苗。

棉花總RNA的提取、cDNA第一鏈的合成和熒光定量 PCR參照張蕓等[10]方法。將棉花中高度保守的ubiquitin作為內(nèi)參，目的基因?yàn)?CL（4-香豆酰-CoA連接酶）、CHI（幾丁質(zhì)酶）、POD（過氧化物酶）、PPO（多酚氧化酶）和PAL（苯丙氨酸解氨酶），特異引物見表1。

表1　相關(guān)基因的特異性引物序列Table 1　Specific primer sequence of related genes

1.5　防御相關(guān)酶的活性測(cè)定

棉苗培育、Vd171和Vd080的接種方法同1.2第1組試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)處理，接種Vd080前4 d接種Vd171及清水。每處理30個(gè)營養(yǎng)缽，每缽留苗5株。接種Vd080前，每處理隨機(jī)取20棵苗，用清水沖洗干凈后，放入滅菌水中沖洗，分為下胚軸和真葉兩部分，分別稱取1 g鮮重，0℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將理論模型中參數(shù)賦值后即可模擬目標(biāo)價(jià)格變動(dòng)對(duì)市場(chǎng)均衡及社會(huì)福利的影響。上述理論模型涉及9個(gè)參數(shù)，其中3個(gè)參數(shù)需要使用計(jì)量經(jīng)濟(jì)學(xué)方法估計(jì)獲得，分別是試點(diǎn)區(qū)和非試點(diǎn)區(qū)供給彈性以及替代彈性，本文將借鑒前人的研究結(jié)果，其他6個(gè)參數(shù)可以根據(jù)變量的初始值計(jì)算獲得(見表2)。

過氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）用 50 mmol·L-1Tris-HCl buffer（pH 7.5）為提取液，每克鮮樣加入 0.05 g PVP；多酚氧化酶（PPO）用 0.1 mol·L-1KH2PO4（pH 6.0）為提取液，每克鮮樣加入0.05 g聚乙烯基吡咯烷酮；取 2 g鮮樣加入 10 mL HAc-NaAc緩沖液，得到幾丁質(zhì)酶（CHI）的粗提液；酶液抽提物均4℃保存?zhèn)溆?。POD、PPO、PAL和CHI活性測(cè)定分別參照FERRER等[11-14]的方法。

1.6　Vd171誘導(dǎo)棉花活性氧爆發(fā)的測(cè)定

棉苗培育及Vd171接種方法同1.2第1組試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)處理，接種Vd080前4 d接種Vd171及接種清水（對(duì)照）。接種Vd171 48 h后取長勢(shì)相近的植株的真葉進(jìn)行活性氧檢測(cè)，檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[14]。

1.7　Vd171誘導(dǎo)棉花木質(zhì)部的加厚

棉苗培育及Vd171接種方法同1.2第1組試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)置 4個(gè)處理，分別為 Vd171+清水、Vd171+Vd080、清水+清水（對(duì)照）、清水+Vd080（對(duì)照），兩次接種間隔4 d。接種Vd080后2 d取長勢(shì)相近的棉花，橫切下胚軸，將切片置于載玻片上，用10%的間苯三酚染液（溶于無水乙醇中）染色2 min，用濃硫酸孵育片刻，置于光學(xué)顯微鏡下迅速觀察拍照[15]。

1.8　數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)各處理的病情指數(shù)進(jìn)行差異顯著性分析，對(duì)基因表達(dá)量及根表黃萎病菌孢子數(shù)量進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1　Vd171誘導(dǎo)棉花對(duì)黃萎病的抗性作用

2.1.1不同接種時(shí)間與誘導(dǎo)抗病效果在冀棉11播種后21 d蘸根接種大麗輪枝菌強(qiáng)致病力菌株Vd080，在接種Vd080前2、4、6、8 d和之后的1、2、4 d，蘸根接種弱致病力菌株 Vd171。接種 Vd080后 15 d的調(diào)查結(jié)果顯示，對(duì)照處理的病株率和病情指數(shù)分別為65.6%和39.6，達(dá)到感病水平；接種Vd080前2、4、6、8 d接種Vd171的4個(gè)處理，病情指數(shù)為3.2—9.8，極顯著低于對(duì)照，對(duì)黃萎病的防治效果分別為82.8%、91.8%、80.7%和75.0%。接種Vd080后25 d的調(diào)查結(jié)果表明，對(duì)照處理的病株率和病情指數(shù)分別為 78.4%和57.6，達(dá)到高感水平；接種Vd080之前2、4、6、8 d接種Vd171的4個(gè)處理，病情指數(shù)為7.5—15.9，極顯著低于對(duì)照，防治效果分別78.7%、87.0%、78.8%和72.3%；其中，前4 d接種Vd171處理誘導(dǎo)抗性效果最好，對(duì)棉花黃萎病的平均防效為 89.4%，依次是2、6和 8 d，平均防治效果分別為 80.8%、79.8%和73.7%。兩次調(diào)查結(jié)果表明，接種Vd080之后1、2和4 d接種Vd171，病情指數(shù)與對(duì)照沒有顯著差異，平均防治效果分別為2.1%、3.2%和1.4%和3.0%。表明在接種Vd080之前2、4、6、8 d接種弱致病力菌株Vd171均對(duì)棉花黃萎病具有顯著的交叉保護(hù)作用，以前 4 d接種Vd171效果最好；接種Vd080之后再接種Vd171對(duì)棉花黃萎病沒有控制作用（表2）。

表2　不同時(shí)期接種Vd171對(duì)棉花黃萎病的誘導(dǎo)抗性效果Table 2　Induced resistance effects of Vd171 against Verticillium wilt in cotton in different inoculation periods

2.1.2不同接種方法與誘導(dǎo)抗病效果接種 Vd080后15 d，對(duì)照處理的病株率和病情指數(shù)分別為46.1%和36.2，達(dá)感病水平；在5種接種Vd171不同方法的處理中，以蘸根和葉面噴霧效果最好，對(duì)黃萎病的防治效果分別為 80.3%和 73.9%，兩個(gè)處理的病情指數(shù)均極顯著低于對(duì)照，兩者之間差異不顯著；其次是浸種和灌根，防治效果分別為 60.0%和 47.3%，兩個(gè)處理的病情指數(shù)也均極顯著低于對(duì)照，兩者之間差異不顯著；莖部針刺處理效果最差，防治效果只有3.2%，病情指數(shù)與對(duì)照差異不顯著。接種Vd080后25 d，對(duì)照的病株率和病情指數(shù)分別為69.6%和54.5，達(dá)高感水平；5種接種Vd171方法中，仍然以蘸根效果最好，對(duì)黃萎病的防治效果為59.7%，病情指數(shù)極顯著低于對(duì)照；其次是葉面噴霧、灌根和浸種，對(duì)黃萎病的防治效果為29.9%—34.6%，病情指數(shù)均極顯著低于對(duì)照，三者之間差異不顯著；莖部針刺處理效果最差，防治效果只有1.1%，病情指數(shù)與對(duì)照差異不顯著。幾種接種方法相比較，蘸根＞葉面噴霧、浸種和灌根＞針刺（表3）。

2.1.4不同接種體類型的誘導(dǎo)抗病效果采用蘸根接種方法，在接種Vd080前4 d分別接種Vd171分生孢子和培養(yǎng)濾液，探討Vd171不同組分對(duì)黃萎病的誘導(dǎo)抗性作用。接種Vd080后15 d和25 d的調(diào)查結(jié)果表明，兩個(gè)接種處理均具有較好的誘導(dǎo)抗性作用，在對(duì)照處理病情指數(shù)達(dá)38.4和55.6情況下，兩處理的病情指數(shù)分別為3.3—3.5和11.0—16.3，均極顯著低于對(duì)照，平均防治效果為81.1%—85.6%，二者之間差異不顯著；先接種清水和查氏培養(yǎng)基的兩個(gè)對(duì)照之間無顯著差異（表5）。

表3　Vd171不同接種方法對(duì)棉花黃萎病的誘導(dǎo)抗性效果Table 3　Induced resistance effects against Verticillium wilt in cotton by different inoculation methods of Vd171

表4　接種Vd171次數(shù)對(duì)棉花黃萎病的誘導(dǎo)抗性效果Table 4　Induced resistance effects against Verticillium wilt in cotton by different inoculation times of Vd171

表5　Vd171不同接種體類型對(duì)黃萎病的誘導(dǎo)抗性效果Table 5　Induced resistance effects against Verticillium wilt in cotton by different inoculum types of Vd171

2.2　Vd171誘導(dǎo)抗性的作用機(jī)制

2.2.1接種 Vd171對(duì)黃萎病菌在棉苗根部定殖和棉株體內(nèi)擴(kuò)展的影響將水培 12 d的棉苗分別先接種Vd171和清水，4 d后接種Vd080GFP，接種Vd080GFP后1、2、3和4 d觀察棉苗根表Vd080GFP分生孢子的數(shù)量。結(jié)果表明，先接種Vd171處理各時(shí)段分生孢子的數(shù)量分別為8.0×106、7.9×106、6.6×106和4.4×106/g，均低于清水對(duì)照（14.1×106、13.7×106、7.8×106、7.7×106/g），其中1、2和4 d時(shí)差異達(dá)極顯著水平（圖 1）。表明先接種弱致病力菌株Vd171降低了之后棉苗根系與強(qiáng)致病力菌株 Vd080GFP分生孢子的結(jié)合能力。

圖1　接種Vd171對(duì)棉苗根表黃萎病菌數(shù)量的影響Fig. 1　Effects of Vd171 inoculation on V. dahliae conidia number on the root surface of cotton seedlings

接種Vd080GFP后7 d，兩處理分別隨機(jī)取樣15株，分為上、中、下3段，分離棉花黃萎病菌，先接種Vd171處理不同部位均未分離到棉花黃萎病菌（圖2-A—C），而接種清水的對(duì)照 3個(gè)部位均分離到棉花黃萎病病菌，上、中、下3段分離率分別為6.7%、20%和20%（圖2-D—F）。所有分離到的病原菌經(jīng)熒光觀察，均產(chǎn)生熒光，確定為Vd080GFP。

圖2　接種Vd171對(duì)黃萎病菌在棉株內(nèi)擴(kuò)展的影響Fig. 2　Effects of Vd171 inoculation on development of pathogens in cotton stem

2.2.2接種 Vd171對(duì)棉花防御相關(guān)基因表達(dá)量的影響qPCR測(cè)定結(jié)果表明，與接種清水對(duì)照相比，接種Vd171的處理棉花根部GhPOD和GhPPO表達(dá)量均沒有明顯的變化（圖3-D、3-E），而GhPAL、Gh4CL和GhCHI的表達(dá)量則發(fā)生明顯變化。接種清水的對(duì)照中，0—72 h GhPAL和Gh4CL的表達(dá)量均逐漸減少，而接種Vd171的處理中則表現(xiàn)先升高后降低，且均較對(duì)照明顯提高，其中，GhPAL在接種Vd171 12 h后表達(dá)量達(dá)到最高，為對(duì)照處理的2.2倍（圖3-A）；而Gh4CL在接菌24 h后表達(dá)量達(dá)到最高，為對(duì)照處理的8.5倍（圖3-B）。對(duì)照處理中 GhCHI的表達(dá)量隨時(shí)間延長而逐漸降低，與之相比，接種Vd171的處理中GhCHI的表達(dá)量為持續(xù)高表達(dá)趨勢(shì)，較對(duì)照明顯提高，在接種后的36 h差異最大，為對(duì)照的2.6倍，達(dá)差異顯著水平（圖3-C）。

圖3　接種Vd171對(duì)防御相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 3　Effects of Vd171 inoculation on expression of defense-related genes

表6　先接種Vd171對(duì)棉苗防御相關(guān)酶活性的影響Table 6　Effect of pre-inoculated by Vd171 on activity of resistance-related enzymes in cotton seedlings

2.2.3先接種Vd171對(duì)棉花防御相關(guān)酶活性的影響接種 Vd080前測(cè)定棉苗下胚軸和真葉中防御相關(guān)酶活性的變化，結(jié)果表明與對(duì)照相比先接種 Vd171處理棉苗下胚軸中PPO、PAL、POD和CHI酶活性均極顯著高于對(duì)照，分別較對(duì)照提高31.9%、131.0%、57.1%和102.1%；子葉中PAL、CHI和POD酶活性顯著高于對(duì)照，分別較對(duì)照提高 22.1%、39.6%和7.1%，PPO酶活性與對(duì)照沒有顯著差異（表6）。該結(jié)果與上述基因表達(dá)情況一致，表明 Vd171誘導(dǎo)了棉花苯丙烷代謝作用的增強(qiáng)及幾丁質(zhì)酶的表達(dá)，提高了棉花抗病性。

2.2.4先接種 Vd171誘導(dǎo)活性氧爆發(fā)蘸根接種Vd171分生孢子懸浮液48 h后，在葉片中觀察到較多的褐色沉淀，而接種清水的對(duì)照中，褐色沉淀較少，表明Vd171引起了棉花葉片活性氧的爆發(fā)（圖4）。

圖4　Vd171引起棉花葉片活性氧爆發(fā)Fig. 4　Vd171 triggered ROS in cotton leaves

2.3　Vd171誘導(dǎo)木質(zhì)部的增厚

顯微鏡觀察結(jié)果表明，與只接種清水對(duì)照相比，接種Vd171和Vd080的處理木質(zhì)部均明顯增厚；先接種Vd171再接種Vd080的處理，幼苗木質(zhì)部進(jìn)一步增厚，表明Vd171能夠誘導(dǎo)棉苗維管束細(xì)胞發(fā)生明顯的木質(zhì)化，以抵御之后黃萎病菌的侵染和擴(kuò)展（圖5）。

圖5　棉花莖部橫切面細(xì)胞木質(zhì)化情況Fig. 5　Histochemical analysis of lignin in stem cross-sections of cotton

3　討論

研究證明，植物具有抵抗各種病害的潛在能力，人們可以采用適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)處理使這種潛能表達(dá)出來，使感病植物表現(xiàn)抗病，而且抗性比較穩(wěn)定，還能抵抗多種病害，它克服了以往一些防治措施存在的不足。目前，這方面的研究已有不少成功的實(shí)例[16-18]。在棉花黃萎病方面研究較多的是利用拮抗細(xì)菌枯草芽孢桿菌[19-21]，也有研究采用棉花內(nèi)生的蠟狀芽孢桿菌[15]、球毛殼真菌[10]、黑白輪枝菌[22]和變黑輪枝菌[6,23]來誘導(dǎo)棉花對(duì)黃萎病的抗性，以達(dá)到控制病害的目的。把弱毒株系接種到無病健康的植株上，經(jīng)一段時(shí)期后，當(dāng)同種病原菌的強(qiáng)毒株系再次侵染時(shí)，由于該植株已產(chǎn)生免疫能力，抵抗或削弱強(qiáng)毒菌株的侵染，使植株發(fā)病減輕或不發(fā)病而受到保護(hù)，即交叉保護(hù)[16]。這種現(xiàn)象在病毒病中研究較多，而真菌性病害研究較少。在棉花黃萎病方面，已有的研究表明弱致病力菌株具有誘導(dǎo)抗性的作用[5-6]，至于其具體的使用方法、誘導(dǎo)抗性的機(jī)制并不清楚。本研究以一株分離自棉花的致病力極弱的大麗輪枝菌Vd171為對(duì)象，不同的接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在接種Vd080前4 d蘸根接種Vd171的分生孢子懸浮液，對(duì)黃萎病的防治效果最好，達(dá)到 89.4%，這與現(xiàn)有的研究結(jié)果相一致[5-6]。本研究還發(fā)現(xiàn)用分生孢子懸浮液葉面噴霧、浸種和灌根，也具有一定的防治效果，Vd171的培養(yǎng)濾液和分生孢子懸浮液具有同樣的效果，該試驗(yàn)結(jié)果預(yù)示可以將Vd171研制成不同劑型，通過滴灌、噴霧和浸種來控制黃萎病。本研究中，接種Vd080后再接種Vd171則不具備交叉保護(hù)的作用，這也提示，無論是滴灌還是噴霧，均需要在黃萎病發(fā)生之前進(jìn)行。

前期研究表明，將CVn-WHg（Vd171）與CVd-AYb（大麗輪枝菌強(qiáng)致病力菌株） 1∶1混勻接種棉花，對(duì)黃萎病的交叉保護(hù)效果顯著低于單獨(dú)的CVn-WHg，由此認(rèn)為CVn-WHg對(duì)棉株根系生態(tài)位的競(jìng)爭在交叉保護(hù)作用中具有重要作用[6]。本研究中，先接種Vd171能阻止之后Vd080在棉花根部的定殖，同樣支持了上述觀點(diǎn)。

除了生態(tài)位競(jìng)爭，誘導(dǎo)免疫是交叉保護(hù)的重要作用機(jī)制，主要包括產(chǎn)生植物保衛(wèi)素、抗病相關(guān)酶活性的增加、啟動(dòng)植物組織的木質(zhì)化反應(yīng)、產(chǎn)生免疫信息物質(zhì)等[18-20]。ROS（活性氧）不僅是植物有氧代謝的副產(chǎn)物，也是重要的信號(hào)分子，參與調(diào)控植物的生長發(fā)育以及各種脅迫反應(yīng)，當(dāng)植物體遭受病原菌侵害時(shí)，細(xì)胞壁上會(huì)產(chǎn)生ROS，進(jìn)而激活植物體的防御反應(yīng)[24-25]；本研究中也檢測(cè)到經(jīng) Vd171誘導(dǎo)后，棉苗葉片有明顯的活性氧產(chǎn)生，這與周京龍等[15]利用蠟狀芽孢桿菌誘導(dǎo)棉花產(chǎn)生的免疫反應(yīng)結(jié)果一致。本研究中發(fā)現(xiàn)接種Vd171處理的棉苗根部GhPAL和Gh4CL表達(dá)量顯著升高，酶活性測(cè)定也表明下胚軸和真葉中 PAL的活性較對(duì)照提高了131.0%和22.1%，PAL和4CL是苯丙烷類衍生物代謝途徑的關(guān)鍵酶[26-27]，說明Vd171誘導(dǎo)了棉花苯丙烷代謝作用的增強(qiáng)。苯丙烷代謝途徑是植物3大次生代謝途徑之一，其代謝產(chǎn)物酚類和異黃酮類植保素以及木質(zhì)素等在植物抗病中起著化學(xué)屏障作用[28-30]。本研究中，接種Vd171可以誘導(dǎo)棉苗根部幾丁質(zhì)酶基因CHI的表達(dá)，在下胚軸和子葉中的活性也顯著提高，Vd171還能夠誘導(dǎo)棉苗維管束細(xì)胞發(fā)生明顯的木質(zhì)化，經(jīng)Vd171誘導(dǎo)的棉苗莖部分離到的病原菌明顯較少；因此，推測(cè)苯丙烷代謝作用的增強(qiáng)可能調(diào)控了木質(zhì)素的生物合成，提高了木質(zhì)素的積累量，增強(qiáng)了棉花機(jī)械結(jié)構(gòu)組織，從而提高其抵御病原微生物在棉株內(nèi)擴(kuò)展的能力。

4　結(jié)論

溫室苗期先接種大麗輪枝菌弱致病力菌株Vd171的分生孢子或培養(yǎng)濾液可以有效地誘導(dǎo)棉花對(duì)黃萎病產(chǎn)生抗性，其誘導(dǎo)免疫的機(jī)制主要是阻止之后棉花黃萎病菌在棉株根部的定殖和植株體內(nèi)的擴(kuò)展，誘導(dǎo)棉苗防御相關(guān)基因的表達(dá)及酶活性的增強(qiáng)，從而減輕黃萎病的發(fā)生危害。該研究預(yù)示弱致病力菌株Vd171可以作為植物疫苗應(yīng)用于棉花黃萎病的防治，具有較好的應(yīng)用前景。

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