谷瘟病菌無毒基因型鑒定及分析

任世龍，白輝，王永芳，全建章，董志平，李志勇，邢繼紅

（1河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所/河北省雜糧重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家谷子改良中心，石家莊 050035；2河北農(nóng)業(yè)大學(xué)/河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071001）

0　引言

【研究意義】谷瘟病（致病菌Magnaporthe oryzae）是谷子生產(chǎn)中重要的流行性病害之一[1]，嚴(yán)重時(shí)可造成大面積減產(chǎn)甚至絕收[2]，種植谷子抗病品種是防治谷瘟病最經(jīng)濟(jì)、有效的措施。谷瘟病菌極易發(fā)生變異[3]，因此鑒定各地區(qū)谷瘟病菌的無毒基因類型，了解谷瘟病菌無毒基因的分布及變異情況，可為谷子抗病基因的克隆指明方向。【前人研究進(jìn)展】近年來在谷子抗瘟性鑒定方面開展了系列研究，而谷瘟菌的遺傳變異研究鮮有報(bào)道。李志江等[4]利用采自谷子主產(chǎn)區(qū)的10個(gè)谷瘟病菌的單孢菌株對(duì)60份選自谷子核心種質(zhì)資源的品種進(jìn)行苗期接種鑒定，構(gòu)建了谷瘟病菌生理小種的鑒別標(biāo)準(zhǔn)品種體系；SHARMA等[5]利用谷瘟病菌對(duì)155份谷子核心種質(zhì)資源進(jìn)行抗病鑒定，在溫室接菌鑒定中，155個(gè)品種中有11個(gè)表現(xiàn)出對(duì)同一谷瘟病菌菌種具有相同的抗病能力；任世龍等[6]通過對(duì)64個(gè)谷瘟病菌的rDNA-IGS序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)谷瘟病菌的遺傳分化非常明顯，具有豐富的多樣性，且具有寄主特異性。至今，谷瘟病菌無毒基因的相關(guān)研究尚未見報(bào)道，而稻瘟病菌無毒基因的相關(guān)研究已有大量報(bào)道。已有的研究發(fā)現(xiàn)，谷瘟病菌與谷子之間的互作關(guān)系與稻瘟病菌與水稻之間的互作相似，均符合Flor的“基因?qū)颉睂W(xué)說[7]。稻瘟病菌在侵染水稻過程中，水稻中的抗病基因與稻瘟病菌無毒基因編碼產(chǎn)物相互作用，可引發(fā)寄主過敏性壞死反應(yīng)（HR），從而抑制稻瘟病菌的進(jìn)一步侵染，進(jìn)而產(chǎn)生抗病作用[8-9]。病原菌在侵染寄主和寄主抵抗病原菌侵染的過程中具有強(qiáng)烈的相互選擇，促使病原菌與寄主協(xié)同進(jìn)化發(fā)展[10-11]。目前，多個(gè)稻瘟病菌的無毒基因被成功克隆，如 Avr1-CO39[12]、Avr-pita[13]、ACE1[14]、AvrPiz-t[15]、Avr-pii、Avr-pia 和 Avr-pik[16]等。JIA 等[17]通過酵母雙雜交試驗(yàn)確定了 Avr-pita176蛋白可直接結(jié)合到Pi-ta LRD區(qū)域，在植物細(xì)胞內(nèi)啟動(dòng)Pi-ta介導(dǎo)的防御反應(yīng)，并證實(shí)了“基因?qū)颉睂W(xué)說；IMAM等[18]將從印度東部的水稻種植區(qū)分離獲得的63株稻瘟病菌用于該地區(qū)無毒基因的分布研究，發(fā)現(xiàn)AvrPiz-t和Avr-pik的分布水平為100%，Avr1-CO39的分布水平最低，僅為 2%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】谷瘟病菌與稻瘟病菌同屬于有絲分裂孢子真菌中梨孢屬（無性態(tài)為 Pyricularia）的不同寄主分離物，稻瘟病菌中已克隆無毒基因可為谷瘟病菌無毒基因的克隆提供參考。本研究根據(jù)已克隆的7個(gè)稻瘟病菌無毒基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)中國(guó)谷子主產(chǎn)區(qū)的76個(gè)谷瘟病菌菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)，分析其含有的無毒基因的類型及變異情況。【擬解決的關(guān)鍵問題】鑒定不同地區(qū)谷瘟病菌所攜帶的無毒基因類型，確定無毒基因在菌株中的分布情況及其變異情況，為深入研究谷瘟病菌無毒基因變異機(jī)制打下基礎(chǔ)，并為谷子抗病基因的克隆提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

2014—2016年，從中國(guó)北方谷子產(chǎn)區(qū)采集具有典型谷瘟病癥狀的谷子病樣，從中分離純化谷瘟病菌，共分離獲得谷瘟病菌單孢菌株76株（表1）。

表1　76個(gè)谷瘟病菌供試菌株Table 1　Seventy-six strains of M. oryzae from foxtail millet

1.2　谷瘟病菌DNA的提取

將分離純化的谷瘟病菌單孢菌株在 PDA固體培養(yǎng)基上活化，挑取適量菌體轉(zhuǎn)接到 PDB液體培養(yǎng)基中，室溫靜止培養(yǎng)10 d，收集菌絲體，采用常規(guī)CTAB法提取谷瘟病菌的基因組DNA。

1.3　引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中7個(gè)已克隆的稻瘟病菌的無毒基因序列，利用 Primer5軟件設(shè)計(jì)無毒基因的引物，委托生工生物工程（上海）股份有限公司（上海生工）進(jìn)行合成。引物序列見表2。

1.4　PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Ex Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，模板 DNA 2 μL（≤200 ng），ddH2O 9.5 μL，總體積25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，51—58℃（根據(jù)不同引物而定）退火30 s，72℃延伸30—60 s，共35次循環(huán)；72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表2　用于擴(kuò)增無毒基因的引物Table 2　Primers used for Avr-gene amplification

1.5　無毒基因的克隆測(cè)序及序列分析

使用凝膠回收試劑盒（美吉生物）進(jìn)行PCR產(chǎn)物膠回收，回收產(chǎn)物與pMD19-T Vector 載體（寶生物工程有限公司）16℃過夜連接，通過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，并將陽性克隆送到上海生工進(jìn)行測(cè)序。采用clustalX2.0軟件對(duì)不同谷瘟病菌無毒基因全部測(cè)序序列進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)分析，挑選具有差異的無毒基因序列，通過在線（http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/）軟件工具對(duì)核苷酸序列進(jìn)行蛋白序列翻譯，最后采用 DNAman5.0軟件對(duì)有差異的核苷酸序列和蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析（文章序列比對(duì)圖均采用DNAman5.0軟件）。

2　結(jié)果

2.1　谷瘟病菌無毒基因的分布

以谷瘟病菌 76個(gè)單孢菌株的基因組 DNA為模板，利用7個(gè)無毒基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，部分菌株的無毒基因擴(kuò)增結(jié)果如圖 1所示。其中菌株P(guān)11和P34的無毒基因Avr1-CO39擴(kuò)增片段較預(yù)期結(jié)果大490 bp，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)11和P34中的Avr1-CO39基因序列完全一致，均在啟動(dòng)子區(qū)插入了490 bp核苷酸，其中477 bp的插入序列與已知大小為477 bp的non-LTR retrotransposon：Mg-SINE（GenBank：AB607334.1）的相似度達(dá) 99.16%（圖 2）。

在76個(gè)谷瘟病菌中，無毒基因ACE1、Avr-pita、Avr1-CO39和 AvrPiz-t的擴(kuò)增率為 100%，Avr-pik、Avr-pia和 Avr-pii的擴(kuò)增率分別為 63.2%、42.1%和21.1%。7個(gè)無毒基因在不同地區(qū)谷瘟病菌中的擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果如表 3所示。無毒基因 ACE1、Avr-pita、Avr1-CO39和AvrPiz-t的擴(kuò)增檢出率為100%，不存在地區(qū)的差異性；無毒基因 Avr-pik、Avr-pia和 Avr-pii以不同頻率在不同地區(qū)出現(xiàn)，除遼寧省Avr-pia的擴(kuò)增檢出率（50.0%）大于 Avr-pik的擴(kuò)增檢出率（33.3%）之外，其余地區(qū)的無毒基因擴(kuò)增檢出率的高低符合 Avr-pik＞Avr-pia＞Avr-pii。無毒基因Avr-pii在各個(gè)地區(qū)谷瘟病菌的擴(kuò)增率均較低，擴(kuò)增率最高的為河北省和遼寧省僅33.3%，最低為新疆自治區(qū)0，但在局部地區(qū)如河北承德Avr-pii的擴(kuò)增率為100%。

2.2　谷瘟病菌群體單元型分析

基于不同無毒基因PCR擴(kuò)增結(jié)果建立0—1數(shù)據(jù)庫，7 個(gè)無毒基因 Avr-pita、AvrPiz-t、Avr-CO39、ACE1、Avr-pik、Avr-pia和Avr-pii的特異性指紋片段以a、b、c、d、e、f、g代替，將含有相同無毒基因帶型的菌株歸為一個(gè)單元型。結(jié)果顯示76個(gè)供試菌株可以歸為包含全部理論可能的8種不同的單元型（表4）。其中單元型AG2包含23個(gè)菌株，占供試菌株的 30.2%，此類型菌株出現(xiàn)的頻率最高，為優(yōu)勢(shì)單元型；單元型AG1和AG5，分別包含15和14個(gè)菌株，占供試菌株比例分別為19.7%和18.4%，說明供試谷瘟病菌菌株在群體遺傳結(jié)構(gòu)上層次較為豐富。

圖1　部分菌株的無毒基因的PCR擴(kuò)增Fig. 1　The PCR detection of Avr-genes in partial strains

表3　7個(gè)無毒基因在不同地區(qū)谷瘟病菌中的擴(kuò)增檢出率Table 3　The detection rates of 7 avirulent genes of M. oryzae from different regions

2.3　谷瘟病菌無毒基因的變異分析

2.3.1無毒基因Avr-pia的變異分析對(duì)全部32株谷瘟病菌的Avr-pia進(jìn)行克隆測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，Avr-pia可劃分為4種類型。類型一：Avr-pia-A與參考序列（AB498873.1）一致，以P41菌株為代表，包含10個(gè)菌株；類型二：Avr-pia-B以P5菌株為代表，包含20個(gè)菌株。以起始密碼子的第一個(gè)堿基為+1位，上游為負(fù)，下游為正，該類型與參考序列相比均在-116、-109和-16 bp處分別存在C/T、G/T和C/A變異，但與參考序列的 CDS區(qū)序列相同；類型三：Avr-pia-C型僅包含菌株 P10，除包含 Avr-pia-B型菌株的變異以外，在+150 bp處存在T/G變異，但為同義突變；類型四：Avr-pia-D僅包含菌株P(guān)18，除包含Avr-pia-B型菌株的變異以外，在+212 bp位點(diǎn)處存在C/T變異，導(dǎo)致該變異位點(diǎn)由編碼蘇氨酸變?yōu)榫幋a異亮氨酸，該變異可能會(huì)使Avr-pia喪失無毒基因功能（圖3）。

圖2　谷瘟病菌P11插入核苷酸序列與non-LTR retrotransposon: Mg-SINE核苷酸序列比對(duì)分析Fig. 2　Sequence comparison analysis between inserted nucleotide sequence of P11 of M. oryzae and nucleotide sequence of non-LTR retrotransposon: Mg-SINE

表4　谷瘟病菌的單元型Table 4　Haplotypes of M. oryzae strains

圖3　供試菌株的Avr-pia序列比對(duì)Fig. 3　Sequence comparison of Avr-pia of tested strains

2.3.2無毒基因Avr-pii的變異分析對(duì)全部16株谷瘟病菌的Avr-pii序列進(jìn)行克隆測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，谷瘟病菌Avr-pii可以劃分為3種類型（Avr-pii-A、Avr-pii-B和Avr-pii-C）。Avr-pii-A型共包含14個(gè)菌株，以菌株 P4為代表，與參考序列（AB498874.1）一致；菌株P(guān)6在+139 bp處存在A/G變異，命名為Avr-pii-B型；菌株 P3在+64 bp處存在 A/G變異，命名為Avr-pii-C型，核苷酸的變異導(dǎo)致該位點(diǎn)由編碼蘇氨酸改為丙氨酸，Avr-pii-B型和Avr-pii-C型變異均為首次報(bào)道（圖4）。

2.3.3無毒基因Avr-pita部分菌株變異分析隨機(jī)選取8株谷瘟病菌的Avr-pita進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與參考序列（AF207841.1）相比，Avr-pita序列變異豐富，主要變異形式包括單核苷酸的插入、缺失及多處位點(diǎn)的SNP。其中菌株P(guān)47與已報(bào)道的毒性菌株S06-13-1相似，在+31 bp處缺失T堿基，會(huì)使得Avr-pita失去無毒基因功能，導(dǎo)致與寄主不發(fā)生 Pi-ta介導(dǎo)的抗病反應(yīng)，代表菌株堿基序列比對(duì)如圖5所示。

圖4　供試菌株的Avr-pii序列比對(duì)Fig. 4　Sequence comparison of Avr-pii of tested strains

圖5　供試菌株的Avr-pita 堿基序列比對(duì)Fig. 5　Nucleotide sequence of Avr-pita of tested strains

3　討論

近年來，谷瘟病在谷子主要產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，河北、河南、山東等夏谷區(qū)發(fā)生尤為嚴(yán)重，生產(chǎn)上高感谷子品種的推廣，加劇了谷瘟病的暴發(fā)。鑒定不同地區(qū)谷瘟病菌的無毒基因類型，可為將來克隆相應(yīng)抗病基因，進(jìn)而培育相關(guān)抗性基因的谷子品種提供參考。

FARMAN等[19]對(duì)來自中國(guó)和日本等國(guó)的稻瘟病菌菌株Avr1-CO39區(qū)域基因組序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大部分菌株的Avr1-CO39位點(diǎn)被單拷貝的RETRO5反轉(zhuǎn)座子和一個(gè)重復(fù)元件 REP1代替，基因組雜交表明RETRO5和REP廣泛分布于稻瘟病菌中；TOSA等[20]對(duì)分離自水稻和馬唐等寄主的梨孢菌進(jìn)行Avr1-CO39序列分析，發(fā)現(xiàn)寄主為水稻的稻瘟病菌中的Avr1-CO39都不完整，而其他寄主的梨孢菌菌株具有完整的Avr1-CO39結(jié)構(gòu)。與稻瘟病菌不同，本試驗(yàn)中所有谷瘟病菌中均檢測(cè)出了Avr1-CO39，說明Avr1-CO39在谷瘟病菌進(jìn)化中較為保守。Avr1-CO39的序列分析發(fā)現(xiàn)，來源地分別為陜西榆林和山西長(zhǎng)治的谷瘟病菌菌株 P11和 P34具有相同的 Avr1-CO39序列，均在Avr1-CO39的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生490 bp的基因插入，該插入序列與非長(zhǎng)末端重復(fù)序列（非 LTR）的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Mg-SINE的相似度達(dá)99.16%。研究發(fā)現(xiàn)，非長(zhǎng)末端重復(fù)序列反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在大多數(shù)真核生物的基因組存在，可產(chǎn)生內(nèi)源性突變，成為潛在的基因毒性來源[21]。由此推測(cè)，菌株P(guān)11和P34可能是谷瘟病菌在與當(dāng)?shù)毓茸悠贩N的長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過程中為了躲避寄主谷子中抗性基因的識(shí)別而發(fā)生的變異，Avr1-CO39啟動(dòng)子區(qū)插入490 bp的片段后，該無毒基因是否有可能變?yōu)槎拘曰颍瑥亩朔闹鞯目共⌒?，還待進(jìn)一步研究。

TAKAHASHI等[22]研究發(fā)現(xiàn)，毒性菌株S06-13-1中，由于Avr-pita的位點(diǎn)+31 bp處缺失了一個(gè)堿基T，導(dǎo)致寄主不發(fā)生Pi-ta介導(dǎo)的抗病反應(yīng)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，谷瘟菌株P(guān)47中的Avr-pita序列在+31 bp處缺失了一個(gè)堿基T，與毒性菌株S06-13-1中的序列相似，推測(cè)谷瘟菌株P(guān)47中的Avr-pita+31 bp處的突變可能會(huì)導(dǎo)致該無毒基因的功能喪失。ORBACH等[13]研究發(fā)現(xiàn)，無毒菌株的Avr-pita與親本菌株O-137相比編碼的蛋白有2—3個(gè)氨基酸不同，而毒性菌株的Avr-pita與菌株O-137相比編碼的蛋白有7個(gè)氨基酸不同。本試驗(yàn)通過對(duì)8個(gè)谷瘟病菌的Avr-pita序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)谷瘟病菌的 Avr-pita編碼蛋白的氨基酸序列與菌株O-137均有3個(gè)以上的不同位點(diǎn)。谷瘟病菌的Avr-pita是否能夠與谷子發(fā)生Pi-ta介導(dǎo)的抗病反應(yīng)，還需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Avr-pita的變異能力強(qiáng)，形式包括單核苷酸的缺失/點(diǎn)突變/插入等多種類型，這與前人研究結(jié)果相符[23-25]。利用谷瘟病菌 Avr-pita豐富的變異研究谷瘟病菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)可能是一種比較好的方法。

WOOLHOUSE等將病菌的無毒基因與寄主的抗病基因間的協(xié)同進(jìn)化分為Arms race[26]和Red queen[26-27]兩種模式，Arms race模式的基因進(jìn)化多以堿基突變?yōu)橹饕问剑鏏vr-pita[11]。Red queen模式進(jìn)化方式則傾向于基因的增添和缺失，如 Avr-pii和Avr-pia[16]。本試驗(yàn)中，Avr-pii和Avr-pia進(jìn)化的主要方式為基因的增添和缺失，符合Red queen模式。但谷瘟病菌 Avr-pii和 Avr-pia進(jìn)化的方式不僅有基因的增添和缺失，還含有序列內(nèi)的核苷酸突變?cè)斐傻陌被嶙儺?，如谷瘟病菌P18的Avr-pia在+212 bp位點(diǎn)處存在 C/T變異，導(dǎo)致該變異位點(diǎn)由編碼蘇氨酸變?yōu)榫幋a異亮氨酸。說明谷瘟病菌 Avr-pii和Avr-pia的進(jìn)化方式包含Arms race和Red queen兩種模式。YOSHIDA等[16]的研究結(jié)果也表明，Avr-pik的進(jìn)化方式不僅包括基因的增添和缺失，還包括基因內(nèi)核苷酸序列的突變，筆者實(shí)驗(yàn)室對(duì)部分菌株的Avr-pik序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)與YOSHIDA等[16]研究結(jié)果相符，相關(guān)結(jié)果待發(fā)表。

ACE1編碼一個(gè)聚酮合酶和非核糖體肽合成酶的復(fù)合物，在水稻抗性基因識(shí)別真菌次生代謝產(chǎn)物的合成過程中觸發(fā)[14]。余歡等[28]研究表明，只有牛筋草和狗尾草菌株中含有無毒基因ACE1，其他菌株中該基因已經(jīng)缺失。本研究發(fā)現(xiàn)來源不同谷子產(chǎn)區(qū)的76個(gè)谷瘟病菌均能檢測(cè)到ACE1，擴(kuò)增檢出率為100%，說明ACE1在谷瘟病菌進(jìn)化中較為保守，并且沒有丟失。

AvrPiz-t的序列不穩(wěn)定，常發(fā)生變異，其變異機(jī)制主要為點(diǎn)突變導(dǎo)致的核苷酸替換和轉(zhuǎn)座子Pot3的插入導(dǎo)致AvrPiz-t無毒功能的喪失。LI等[15]對(duì)比分析了9個(gè)毒性菌株及無毒菌株的AvrPiz-t序列，發(fā)現(xiàn)有毒菌株70-15中有轉(zhuǎn)座子Pot3的插入和單個(gè)核苷酸的替換。本研究中電泳檢測(cè)未檢測(cè)到 AvrPiz-t含有大片段的基因插入，測(cè)序分析發(fā)現(xiàn) AvrPiz-t序列存在變異，其變異方式主要是堿基的缺失、插入和點(diǎn)突變等。

無毒基因ACE1、Avr-pita、Avr1-CO39和AvrPiz-t在 76個(gè)不同谷子產(chǎn)區(qū)的谷瘟病菌中的擴(kuò)增率為100%，說明這些無毒基因在不同谷子產(chǎn)區(qū)均有分布，不存在地區(qū)的差異性。Avr-pia和 Avr-pii的擴(kuò)增率分別為 42.1%和 21.1%，但這兩種無毒基因的CDS區(qū)相對(duì)保守，在局部谷子種植產(chǎn)區(qū)如河北承德地區(qū)Avr-pii的擴(kuò)增率為100%。Avr-pik的進(jìn)化方式不僅包括基因的增添和缺失，還包括基因內(nèi)核苷酸序列的突變。

4　結(jié)論

谷瘟病菌AG2單元型為優(yōu)勢(shì)單元型，其次是單元型AG1和AG5。明確了不同地區(qū)谷瘟病菌所包含的無毒基因類型及變異方式，具體表現(xiàn)為谷瘟病菌中無毒基因ACE1、Avr-pita、Avr1-CO39和 AvrPiz-t不存在地理來源差異，擴(kuò)增率均為 100%，變異方式主要為單核苷酸變異。而無毒基因 Avr-pik、Avr-pia和Avr-pii在各地分布有差異。其中河南、陜西及吉林等地區(qū)無毒基因Avr-pik擴(kuò)增率超過 70%。山東省的無毒基因Avr-pia的擴(kuò)增率最高為62.5%。變異方式主要為整個(gè)無毒基因的缺失，同樣也包含核苷酸序列的單堿基變異。

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