AMPK對Rab-GAP的調節作用研究

廖健文，岳瑩瑩，牛文彥

（天津醫科大學免疫學系，天津300070）

糖尿病是一種常見的以糖代謝紊亂、血糖水平增高為特征的代謝內分泌疾病[1]。90%的糖尿病是2型糖尿病，其特征是胰島素抵抗[1]，通過非胰島素依賴途徑提高組織器官對葡萄糖的攝取是預防和治療2型糖尿病的關鍵。單磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK）是細胞能量變化的感受器[2]，當AMPK被激活，通過調節下游的信號通路，例如，直接磷酸化乙酰-CoA羧化酶（ACC）和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR），能抑制合成代謝并促進分解代謝。激活AMPK能增加骨骼肌對葡萄糖的攝取，增強胰島素敏感性[3]，運動/肌肉收縮可激活AMPK[4]。TBC1D1和TBC1D4（又稱AS160）是小G蛋白 Rab的GTP酶活化蛋白（Rab-GAP），通過調節其下游的Rab參與GLUT4從細胞內儲存囊泡到細胞膜的轉位[5-7]。TBC1D1和TBC1D4都包含一個Rab-GAP結構域和多個磷酸化位點。迄今發現TBC1D1的磷酸化位點有 Ser237、Ser263、Ser507、Ser565、Thr590和 Thr596[8]，TBC1D4 的磷酸化位點有 Ser318、Ser341、Ser570、Ser588、Ser591、Ser666、Ser704、Ser751、Thr6 42、Thr649[6]。運動收縮激活AMPK，磷酸化 TBC1D1 和TBC1D4，促進骨骼肌細胞葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）向細胞膜轉位轉運葡萄糖進入細胞[7，9]，但AMPK是否位于TBC1D1和TBC1D4的上游，直接調節它們的磷酸化，特別是AMPK對TBC1D1 Thr590和TBC1D4 Ser318的調節作用尚不清楚。本研究應用激活型AMPK腺病毒（Ad-AMPK-CA）感染骨骼肌細胞，檢測AMPK對TBC1D1 Thr590和TBC1D4 Ser318的直接作用，明確它們之間的上下游關系。

1　材料和方法

1.1實驗材料小鼠骨骼肌細胞株C2C12（美國ATCC公司），HEK293β5細胞和激活型AMPK腺病毒重組質粒（Ad-AMPK-CA）由廈門大學林圣彩教授實驗室贈與，DMEM培養基（美國GIBCO公司），胎牛血清（以色列Bioind公司），抗磷酸化ACC、TBC1D1、TBC1D4和β-actin抗體（美國CST公司），偶聯HRP的山羊抗兔抗體（美國JacksonImmuno Research公司），增強化學發光底物檢測試劑盒（美國Millipor公司），Tanon-5200化學發光成像系統（北京原平皓生物技術有限公司）。

1.2實驗方法

1.2.1Ad-AMPK-CA擴增和提取將HEK293細胞接種在6孔板中，待細胞密度長至70%~80%，加入含腺病毒的上清液，感染48~72 h，出現細胞變圓、漂浮、破裂的病變現象。當孔底只剩下50%貼附細胞時，收集細胞，液氮速凍后37℃水浴溶解，反復操作3次，離心收集上清，分裝凍存于-80℃。

1.2.2細胞培養C2C12小鼠骨骼肌細胞分別用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養基接種于6孔板中，在37℃，5%CO2培養箱中培養。待細胞密度達 100%時分別加入 0、40、80、160、320、750 μL的腺病毒，孵育12 h后棄去培養基，加入新鮮的含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養基分別孵育 0、24、48、72 h。

1.2.3細胞內熒光分布檢測細胞成像系統對C2C12小鼠骨骼肌細胞進行熒光檢測分析，確定腺病毒在細胞內表達。

1.2.4MTS 實驗檢測 0、40、80、160、320、750 μL的腺病毒作用于C2C12細胞48 h對細胞生存率的影響，MTS法測定細胞生存率的改變。

1.2.5Western blot檢測蛋白磷酸化用含蛋白酶抑制劑（1 mmol/L Na3VO4，0.5 mmol/L NaF，200 μmol/L PMSF，1 μmol/L PIC）的細胞裂解液裂解細胞后，4 ℃12 000 r/min離心20 min，收集上清。按照BCA Protein Assay Kit說明書測定蛋白濃度，再與5×LSB緩沖液按4∶1的比例混合，沸水浴5 min，10%（v/v）SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品，轉到PVDF膜上，用5%牛奶蛋白封閉1.5 h，再分別用各自一抗4℃孵育過夜，二抗使用偶聯HRP的山羊抗兔IgG孵育1.5 h，蛋白條帶用增強化學發光法檢測。β-actin為內參，Image J軟件定量。

1.3統計學方法采用GraphPad Prism6統計軟件進行統計學分析，實驗數據均以±sx表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1不同濃度的腺病毒在C2C12細胞中的表達腺病毒質粒中帶有綠色熒光蛋白GFP，可通過細胞成像系統檢測腺病毒在C2C12細胞的表達。分別加入0、40、80、160、320、750 μL 的腺病毒感染 C2C12 細胞48 h。如圖1所示，腺病毒均在C2C12中表達，說明腺病毒已轉染到C2C12細胞中。

圖1　不同濃度的Ad-AMPK-CA在C2C12細胞中的表達Fig 1 Expressions of Ad-AMPK-CA in different concentrations in C2C12 cells

2.2感染不同時間后腺病毒在C2C12細胞中的表達加入80 μL的腺病毒分別感染C2C12細胞0、24、48、72 h。如圖 2 所示，在 C2C12 細胞中，腺病毒均有表達，48 h達高峰，72 h后減弱。

圖2C2C12感染Ad-AMPK-CA不同時間后在細胞內的表達Fig 2　Expressions of Ad-AMPK-CA in different time after infection in C2C12 cells

2.3MTS法檢測腺病毒對C2C12細胞活性的影響分別加入 40、80、160、320、750 μL 的腺病毒感染 C2C 12細胞48h。如圖3所示，40、80、160、320、750μL處理組的細胞存活率分別為對照組（0μL）的100.95%、94.23% 、90.64%（P<0.01）、93.25%（P<0.05）、88.56%（P<0.001），說明腺病毒在 160、320、750 μL 時對C2C12細胞具有明顯的細胞毒性，而在低于80 μL時則未表現出細胞毒性，后續實驗應用80 μL腺病毒感染細胞48 h。

圖3Ad-AMPK-CA對C2C12細胞生存率的影響Fig 3 The effect of Ad-AMPK-CA on the viability of C2C12 cells

2.4Western blot檢測ACC S79磷酸化通過檢測AMPK下游蛋白分子ACC的磷酸化明確AMPK的活性。如圖4所示，80 μL Ad-AMPK-CA感染細胞48 h后，感染效率約為90%，ACC磷酸化水平升至對照組的（1.99±0.31）倍（*P<0.05），表明腺病毒發揮作用。

圖4C2C12細胞ACC的磷酸化Fig 4 Phosphorylation of ACC in C2C12 cells

2.5Western blot檢測TBC1D1和TBC1D4的磷酸化如圖5所示，80 μL Ad-AMPK-CA感染48 h后，TBC1D1 Thr590和TBC1D4 Ser318分別升至對照組的（1.68±0.01）倍和（1.71±0.11）倍 ，表明 AMPK可以直接磷酸化這兩個Rab-GAP。

圖5C2C12細胞TBC1D1和TBC1D4的磷酸化Fig 5 Phosphorylation of TBC1D1 and TBC1D4 in C2C12 cells

3　討論

AMPK是絲氨酸/蘇氨酸激酶，其信號通路是治療2型糖尿病的靶點[10-11]。AMPK包括α、β和γ 3種亞基，β和γ亞基起調節作用，α亞基起催化作用，主要代表AMPK的活性。α亞基又分為α1和α2兩個亞型，α1亞型廣泛表達，α2亞型高表達于肝臟、骨骼肌和心肌細胞中[12]。AMPK在不同組織中的調節方式不同，在骨骼肌等外周組織，AMPK激活后，通過增加葡萄糖攝取降低血糖；在肝組織中，激活的AMPK主要通過抑制肝臟葡萄糖的異生和脂質的合成，促進脂質氧化而降低血糖；在脂肪組織中激活AMPK減少脂質生成。總之，AMPK在上述不同的組織中均廣泛表達，降低了機體中葡萄糖和脂肪酸水平，減少了脂質過度堆積，從而改善骨骼肌、脂肪和肝臟的胰島素抵抗，提高胰島素敏感性[13]。AMPK感受細胞能量的變化，細胞內AMP濃度升高激活AMPK，本實驗通過檢測AMPK下游信號分子ACC的磷酸化判斷AMPK的活性。

小G蛋白Rab是一類GTP酶，有與GTP結合的活化形式和與GDP結合的失活形式，作用于特定細胞器使囊泡依次出芽、移動，然后與細胞膜融合等，調節囊泡內吞和外排。TBC1D1和TBC1D4是Rab的GTP酶激活蛋白，其主要功能為通過調節Rab的活性調節GLUT4囊泡向細胞膜的轉位，調節骨骼肌細胞葡萄糖轉運[7,9]。TBC1D1和TBC1D4磷酸化水平升高，其GAP活性被抑制，相關的Rabs被解除抑制，從而促進GLUT4轉位。TBC1D1和TBC1D4有多個磷酸化位點。

胰島素和運動是促進葡萄糖轉運的兩個重要生理因素[14]。TBC1D1和TBC1D4受胰島素調節，參與 GLUT4 轉位。TBC1D4 Thr642、Ser341、Ser704 位點在運動和胰島素作用下均能被磷酸化[15]。AMPK是運動的信號分子，很多研究顯示運動/骨骼肌收縮激活AMPK是引起TBC1D4磷酸化的重要中間信號分子[16-17]。小鼠離體骨骼肌收縮可導致TBC1D4 Ser588、Ser591、Thr642 磷酸化水平升高[18]。有研究者提出，AMPK可能是TBC1D1磷酸化的觸發器，磷酸化的TBC1D1通過加強與14-3-3蛋白結合使Rab-GAP活性下降，從而導致GLUT4轉位[19]。本研究發現，激活型AMPK直接磷酸化TBC1D1 Thr590和 TBC1D4 Ser318，提示 AMPK是 TBC1D1和TBC1D4的上游激酶，可調節TBC1D1 Thr590和TBC1D4 Ser318。

綜上所述，AMPK是兩個 Rab-GAP（TCB1D1和TCB1D4）的上游激酶，可直接磷酸化TBC1D1和TBC1D4。

參考文獻：

[1]Br?ns C,Grunnet L G.MECHANISMS IN ENDOCRINOLOGY:skeletal muscle lipotoxicity in insulin resistance and type 2 diabetes:a causal mechanism or an innocent bystander[J].Eur J Endocrinol,2017,176(2):R67

[2]Krabbe K S,Nielsen A R,Krogh-Madsen R,et al.Brain-derived neurotrophic factor(BDNF)and type 2 diabetes[J].Diabetologia,2007,50(2):431

[3]劉倩，胡芳，牛文彥.AMPK腺病毒載體在小鼠骨骼肌中的表達和作用[J].天津醫科大學學報，2016,22（1）：1

[4]Onh M,Ms J S,Cj D J.AMP-activated protein kinase(AMPK)beta1beta2 muscle null mice reveal an essential role for AMPK in maintaining mitochondrial content and glucose uptake during exercise[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(38):16092

[5]Peck G R,Chavez J A,Roach W G,et al.Insulin-stimulated phosphorylation of the Rab GTPase-activating protein TBC1D1 regulates GLUT4 translocation[J].J Biol Chem,2009,284(44):30016

[6]Roach W G,Chavez J A,Miinea C P,et al.Substrate specificity and effect on GLUT4 translocation of the Rab GTPase-activating protein Tbc1d1[J].Biochem J,2007,403(2):353

[7]Li Z,Yue Y,Hu F,et al.Electrical pulse stimulation induces GLUT4 glucose transporter translocation in C2C12 myotubes that depends on Rab8A,Rab13 and Rab14[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2017,[Epub ahead of print]

[8]Chen S,Murphy J,Toth R,et al.Complementary regulation of TBC1D1 and AS160 by growth factors,insulin and AMPK activators[J].Biochem J,2008,409(2):449

[9]王倩，傅力.TBC1D1/4在有氧運動促進骨骼肌細胞葡萄糖轉運中的作用[J].中國運動醫學雜志，2016,35（8）：770

[10]Chen M B,Mcainch A J,Macaulay S L,et al.Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics[J].J Clin Endocrinol Metab,2005,90(6):3665

[11]Brusq J M,Ancellin N,Grondin P,et al.Inhibition of lipid synthesis through activation of AMP kinase:an additional mechanism for the hypolipidemic effects of berberine[J].J Lipid Res,2006,47(6):1281

[12]Niesler C U,Myburgh K H,Moore F.The changing AMPK expression profile in differentiating mouse skeletal muscle myoblast cells helps confer increasing resistance to apoptosis[J].Exp Physiol,2007,92(1):207

[13]周雯.委陵菜黃酮衍生物抗糖尿病活性及其作用機制研究[Z].博士論文，2013

[14]Richter E A,Hargreaves M.Exercise,GLUT4,and skeletal muscle glucose uptake[J].Physiol Rev,2013,93(3):993

[15]Kramer H F,Witczak C A,Taylor E B,et al.AS160 regulates insulin-and contraction-stimulated glucose uptake in mouse skeletal muscle[J].J Biol Chem,2006,281(42):31478

[16]Treebak J T,Glund S,Deshmukh A,et al.AMPK-mediated AS160 phosphorylation in skeletal muscle is dependent on AMPK catalytic and regulatory subunits[J].Diabetes,2006,55(7):2051

[17]Cartee G D,Wojtaszewski J F.Role of Akt substrate of 160 kDa in insulin-stimulated and contraction-stimulated glucose transport[J].Appl Physiol Nutr Metab,2007,32(3):557

[18]Treebak J T,Taylor E B,Witczak C A,et al.Identification of a novel phosphorylation site on TBC1D4 regulated by AMP-activated protein kinase in skeletal muscle[J].Am J Physiol Cell Physiol,2010,298(2):C377

[19]CarteeGD,FunaiK.Exerciseandinsulin:Convergenceordivergence atAS160andTBC1D1[J].ExercSportSciRev,2009,37(4):188